Célula-tronco pluripotente induzida - Induced pluripotent stem cell

Colônias de células iPS humanas. As células fusiformes no fundo são células de fibroblastos de camundongo. Apenas as células que constituem a colônia central são células iPS humanas.

As células-tronco pluripotentes induzidas (também conhecidas como células iPS ou iPSCs ) são um tipo de célula - tronco pluripotente que pode ser gerada diretamente a partir de uma célula somática . A tecnologia iPSC foi desenvolvida pelo laboratório de Shinya Yamanaka em Kyoto , Japão , que mostrou em 2006 que a introdução de quatro genes específicos (chamados Myc , Oct3 / 4 , Sox2 e Klf4 ), conhecidos coletivamente como fatores de Yamanaka, codificam fatores de transcrição poderia converter células somáticas em células-tronco pluripotentes. Ele recebeu o Prêmio Nobel de 2012 junto com Sir John Gurdon "pela descoberta de que células maduras podem ser reprogramadas para se tornarem pluripotentes".

As células-tronco pluripotentes são promissoras no campo da medicina regenerativa . Como podem se propagar indefinidamente, bem como dar origem a todos os outros tipos de células do corpo (como neurônios, coração, pâncreas e células do fígado), eles representam uma única fonte de células que podem ser usadas para substituir aquelas perdidas por danos ou doença.

O tipo mais conhecido de célula-tronco pluripotente é a célula-tronco embrionária . No entanto, como a geração de células-tronco embrionárias envolve a destruição (ou pelo menos a manipulação) do embrião em estágio de pré-implantação, há muita controvérsia em torno de seu uso. As linhas de células-tronco embrionárias compatíveis com pacientes agora podem ser derivadas usando transferência nuclear de células somáticas (SCNT).

Uma vez que as iPSCs podem ser derivadas diretamente de tecidos adultos, elas não apenas contornam a necessidade de embriões, mas podem ser feitas de acordo com o paciente, o que significa que cada indivíduo pode ter sua própria linhagem de células-tronco pluripotentes. Esses suprimentos ilimitados de células autólogas poderiam ser usados ​​para gerar transplantes sem o risco de rejeição imunológica. Embora a tecnologia iPSC ainda não tenha avançado a um estágio em que os transplantes terapêuticos tenham sido considerados seguros, as iPSCs estão prontamente sendo usadas em esforços de descoberta de medicamentos personalizados e na compreensão da base da doença específica do paciente.

Yamanaka nomeou os iPSCs com um "i" minúsculo devido à popularidade do iPod e de outros produtos.

Em seu seminário Nobel, Yamanaka citou o trabalho seminal anterior de Harold Weintraub sobre o papel do MyoD na reprogramação do destino da célula para uma linhagem muscular como um precursor importante para a descoberta de IPSCs.

Produção

Veja também: Reprogramação
Um esquema para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas (IPS). (1) Isolar e cultivar células doadoras. (2) Transduzir genes associados a células-tronco nas células por vetores virais. Os glóbulos vermelhos indicam as células que expressam os genes exógenos. (3) Colher e cultivar as células de acordo com a cultura de células ES , usando células alimentadoras mitoticamente inativadas (cinza claro). (4) Um pequeno subconjunto das células transfectadas tornam-se células iPS e geram colônias semelhantes a ES.

As iPSCs são normalmente derivadas da introdução de produtos de conjuntos específicos de genes associados à pluripotência, ou "fatores de reprogramação", em um determinado tipo de célula. O conjunto original de fatores de reprogramação (também chamados de fatores de Yamanaka) são os fatores de transcrição Oct4 (Pou5f1), Sox2 , Klf4 e cMyc . Embora essa combinação seja mais convencional na produção de iPSCs, cada um dos fatores pode ser substituído funcionalmente por fatores de transcrição relacionados, miRNAs , moléculas pequenas ou mesmo genes não relacionados, como especificadores de linhagem.

A derivação de iPSC é normalmente um processo lento e ineficiente, levando de 1 a 2 semanas para células de camundongo e de 3 a 4 semanas para células humanas, com eficiências em torno de 0,01 a 0,1%. No entanto, avanços consideráveis ​​foram feitos para melhorar a eficiência e o tempo que leva para obter iPSCs. Após a introdução de fatores de reprogramação, as células começam a formar colônias que se assemelham a células-tronco pluripotentes, que podem ser isoladas com base em sua morfologia, condições que selecionam seu crescimento, ou através da expressão de marcadores de superfície ou genes repórter .

Primeira geração (mouse)

As células-tronco pluripotentes induzidas foram geradas pela primeira vez pela equipe de Shinya Yamanaka na Universidade de Kyoto , Japão, em 2006. Eles levantaram a hipótese de que genes importantes para a função das células-tronco embrionárias (ESC) podem ser capazes de induzir um estado embrionário em células adultas. Eles escolheram vinte e quatro genes previamente identificados como importantes em ESCs e usaram retrovírus para entregar esses genes aos fibroblastos de camundongos . Os fibroblastos foram projetados para que quaisquer células reativando o gene específico da ESC, Fbx15 , pudessem ser isoladas usando a seleção de antibióticos.

Após a entrega de todos os vinte e quatro fatores, colônias do tipo ESC emergiram que reativaram o repórter Fbx15 e poderiam se propagar indefinidamente. Para identificar os genes necessários para a reprogramação, os pesquisadores removeram um fator de cada vez do pool de vinte e quatro. Por este processo, eles identificaram quatro fatores, Oct4, Sox2, cMyc e Klf4, que foram cada um necessário e, juntos, suficientes para gerar colônias semelhantes a ESC sob seleção para reativação de Fbx15.

Segunda geração (mouse)

Em junho de 2007, três grupos de pesquisa separados, incluindo o de Yamanaka, uma colaboração de Harvard / University of California, Los Angeles e um grupo do MIT , publicaram estudos que melhoraram substancialmente a abordagem de reprogramação, dando origem a iPSCs que eram indistinguíveis dos ESCs . Ao contrário da primeira geração de iPSCs, esses iPSCs de segunda geração produziram camundongos quiméricos viáveis ​​e contribuíram para a linhagem germinativa de camundongos, alcançando assim o "padrão ouro" para células-tronco pluripotentes.

Essas iPSCs de segunda geração foram derivadas de fibroblastos de camundongo pela expressão mediada por retrovírus dos mesmos quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, cMyc, Klf4). No entanto, em vez de usar Fbx15 para selecionar células pluripotentes, os pesquisadores usaram Nanog , um gene que é funcionalmente importante em ESCs. Usando essa estratégia diferente, os pesquisadores criaram iPSCs que eram funcionalmente idênticos aos ESCs.

Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Geração de fibroblastos humanos

A reprogramação de células humanas para iPSCs foi relatada em novembro de 2007 por dois grupos de pesquisa independentes: Shinya Yamanaka da Universidade de Kyoto, Japão, que foi pioneira no método iPSC original, e James Thomson da Universidade de Wisconsin-Madison, que foi o primeiro a derivar o tronco embrionário humano células. Com o mesmo princípio usado na reprogramação de camundongos, o grupo de Yamanaka transformou com sucesso fibroblastos humanos em iPSCs com os mesmos quatro genes principais, Oct4, Sox2, Klf4 e cMyc, usando um sistema retroviral , enquanto Thomson e colegas usaram um conjunto diferente de fatores, Oct4 , Sox2, Nanog e Lin28, usando um sistema lentiviral .

Geração de tipos de células adicionais

A obtenção de fibroblastos para produzir iPSCs envolve uma biópsia de pele e tem havido um esforço para identificar tipos de células que são mais facilmente acessíveis. Em 2008, os iPSCs eram derivados de queratinócitos humanos, que podiam ser obtidos a partir de uma única arrancada de cabelo. Em 2010, as iPSCs foram derivadas de células do sangue periférico e, em 2012, as iPSCs foram feitas de células epiteliais renais na urina.

Outras considerações para o tipo de célula inicial incluem carga mutacional (por exemplo, as células da pele podem abrigar mais mutações devido à exposição aos raios ultravioleta), o tempo que leva para expandir a população de células iniciais e a capacidade de se diferenciar em um determinado tipo de célula.

Genes usados ​​para produzir iPSCs

A geração de células pluripotentes induzidas é crucialmente dependente dos fatores de transcrição usados ​​para a indução.

Oct-3/4 e certos produtos da família de genes Sox (Sox1, Sox2, Sox3 e Sox15) foram identificados como reguladores transcricionais cruciais envolvidos no processo de indução, cuja ausência torna a indução impossível. Genes adicionais, no entanto, incluindo certos membros da família Klf (Klf1, Klf2, Klf4 e Klf5), a família Myc (c-myc, L-myc e N-myc), Nanog e LIN28 , foram identificados como aumentar a eficiência de indução.

  • Oct-3/4 (Pou5f1) Oct-3/4 é um da família dos fatores de transcrição do octâmero ("Oct") e desempenha um papel crucial na manutenção da pluripotência. A ausência de Oct-3/4 emcélulasOct-3/4 + , como blastômeros e células-tronco embrionárias , leva àdiferenciação trofoblástica espontânea, e a presença de Oct-3/4, portanto, dá origem à pluripotência e potencial de diferenciação do embrionário células-tronco. Vários outros genes na família "Oct", incluindo parentes próximos Oct-3/4, Oct1 e Oct6 , falham em induzir a indução, demonstrando assim a exclusividade de Oct-3/4 para o processo de indução. No entanto, uma equipe chefiada por Hans Schöler (que descobriu o gene Oct4 em 1989) mostrou que a superexpressão de Oct4 durante a reprogramação causa alterações epigenéticas que deterioram a qualidade das iPSCs. Em comparação com OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), a nova reprogramação SKM (Sox2, Klf4 e c-Myc) gera iPSCs com potencial de desenvolvimento equivalente a células-tronco embrionárias , conforme determinado por sua capacidade de gerar camundongos totalmente iPSC por meio de tetraplóide complementação de embriões .
  • Família Sox : a família Sox de fatores de transcrição está associada à manutenção da pluripotência semelhante a Oct-3/4, embora esteja associada a células-tronco multipotentes e unipotentes, em contraste com Oct-3/4, que é exclusivamente expressa em células-tronco pluripotentes. Embora Sox2 tenha sido o gene inicial usado para indução por Yamanaka et al., Jaenisch et al. E Thomson et al., Descobriu-se que outros fatores de transcrição na família Sox também funcionam no processo de indução. Sox1 produz células iPS com eficiência semelhante a Sox2, e os genes Sox3 , Sox15 e Sox18 também geram células iPS, embora com eficiência reduzida.
  • Família Klf : Klf4 da família Klf de fatores de transcrição foi inicialmente identificada por Yamanaka et al. e confirmado por Jaenisch et al. Como fator para a geração de células iPS de camundongo e foi demonstrado por Yamanaka et al. como fator de geração de células iPS humanas. No entanto, Thomson et al. relataram que Klf4 era desnecessário para a geração de células iPS humanas e de fato não conseguiu gerar células iPS humanas. Klf2 e Klf4 foram considerados fatores capazes de gerar células iPS, e os genes relacionados Klf1 e Klf5 também, embora com eficiência reduzida.
  • Família Myc : A família Myc de fatores de transcrição são proto-oncogenes implicados no câncer. Yamanaka et al. e Jaenisch et al. demonstraram que c-myc é um fator implicado na geração de células iPS de camundongo e Yamanaka et al. demonstraram que era um fator implicado na geração de células iPS humanas. No entanto, Thomson et al., Yamanaka et al. o uso da família de genes "myc" na indução de células iPS é preocupante para a eventualidade de células iPS como terapias clínicas, pois 25% dos camundongos transplantados com células iPS induzidas por c-myc desenvolveram teratomas letais. N-myc e L-myc foram identificados para induzir em vez de c-myc com eficiência semelhante.
  • Nanog : Em células-tronco embrionárias, Nanog, junto com Oct-3/4 e Sox2, é necessário para promover a pluripotência. Portanto, foi surpreendente quando Yamanaka et al. relataram que Nanog era desnecessário para indução, embora Thomson et al. relatou que é possível gerar células iPS com Nanog como um dos fatores.
  • LIN28 : LIN28 é uma proteína de ligação ao mRNA expressa em células-tronco embrionárias e células de carcinoma embrionário associadas à diferenciação e proliferação. Thomson et al. demonstraram que LIN28 é um fator na geração de iPSC em combinação com OCT4, SOX2 e NANOG.
  • Glis1 : Glis1 é o fator de transcrição que pode ser usado com Oct-3/4, Sox2 e Klf4 para induzir a pluripotência. Apresenta inúmeras vantagens quando usado em vez de C-myc.

Desafios na reprogramação de células para pluripotência

Embora os métodos pioneiros de Yamanaka e outros tenham demonstrado que as células adultas podem ser reprogramadas para células iPS, ainda existem desafios associados a esta tecnologia:

  1. Baixa eficiência: em geral, a conversão para células iPS tem sido incrivelmente baixa. Por exemplo, a taxa na qual as células somáticas foram reprogramadas em células iPS no estudo original de Yamanaka com camundongos foi de 0,01–0,1%. A baixa taxa de eficiência pode refletir a necessidade de um tempo preciso, equilíbrio e níveis absolutos de expressão dos genes de reprogramação. Também pode sugerir a necessidade de raras alterações genéticas e / ou epigenéticas na população de células somáticas original ou na cultura prolongada. No entanto, recentemente foi encontrado um caminho para uma reprogramação eficiente que exigia a regulação negativa do complexo de remodelação e desacetilação do nucleossomo ( NuRD ). A superexpressão de Mbd3, uma subunidade de NuRD, inibe a indução de iPSCs. O esgotamento de Mbd3, por outro lado, melhora a eficiência da reprogramação, que resulta em reprogramação de células iPS determinística e sincronizada (quase 100% de eficiência em sete dias de células de camundongo e humanas).
  2. Inserção genômica: a integração genômica dos fatores de transcrição limita a utilidade da abordagem do fator de transcrição devido ao risco de mutações serem inseridas no genoma da célula-alvo. Uma estratégia comum para evitar a inserção genômica tem sido usar um vetor diferente para entrada. Plasmídeos , adenovírus e vetores de transposon já foram explorados, mas muitas vezes vêm com a desvantagem de um rendimento mais baixo.
  3. Tumorigenicidade: dependendo dos métodos usados, a reprogramação de células adultas para obter iPSCs pode representar riscos significativos que podem limitar seu uso em humanos. Por exemplo, se os vírus são usados ​​para alterar genomicamente as células, a expressão de oncogenes (genes causadores de câncer) pode ser potencialmente desencadeada. Em fevereiro de 2008, os cientistas anunciaram a descoberta de uma técnica que poderia remover oncogenes após a indução da pluripotência, aumentando assim o potencial de uso de células iPS em doenças humanas. Em outro estudo, Yamanaka relatou que é possível criar iPSCs sem o oncogene c-Myc. O processo demorou mais e não foi tão eficiente, mas as quimeras resultantes não desenvolveram câncer. A inativação ou exclusão do supressor de tumor p53, que é um regulador chave do câncer, aumenta significativamente a eficiência da reprogramação. Portanto, parece haver uma compensação entre a eficiência da reprogramação e a geração de tumor.
  4. Reprogramação incompleta: a reprogramação também enfrenta o desafio da completude. Isso é particularmente desafiador porque o código epigenético de todo o genoma deve ser reformatado para aquele do tipo de célula alvo a fim de reprogramar totalmente uma célula. No entanto, três grupos separados foram capazes de encontrar células iPS derivadas de fibroblasto embrionário de camundongo (MEF) que poderiam ser injetadas em blastocistos tetraploides e resultaram no nascimento de camundongos derivados inteiramente de células iPS, encerrando assim o debate sobre a equivalência do tronco embrionário células (ESCs) e iPS em relação à pluripotência.

A tabela à direita resume as principais estratégias e técnicas usadas para desenvolver células iPS nos primeiros cinco anos após a descoberta de Yamanaka et al. Em 2006. Linhas de cores semelhantes representam estudos que usaram estratégias semelhantes para reprogramação.

Esta linha do tempo resume as principais estratégias e técnicas usadas para desenvolver células iPS nos primeiros cinco anos após a descoberta de Yamanaka et al. Em 2006. Linhas de cores semelhantes representam estudos que usaram estratégias semelhantes para reprogramação.

Abordagens alternativas

Imitando fatores de transcrição com produtos químicos

Uma das principais estratégias para evitar os problemas (1) e (2) tem sido o uso de pequenas moléculas que podem imitar os efeitos dos fatores de transcrição. Esses compostos podem compensar um fator de reprogramação que não atinge efetivamente o genoma ou falha na reprogramação por outro motivo; assim, eles aumentam a eficiência da reprogramação. Eles também evitam o problema da integração genômica, que em alguns casos contribui para a gênese do tumor. Os principais estudos usando essa estratégia foram conduzidos em 2008. Melton et al. estudaram os efeitos do ácido valpróico inibidor da histona desacetilase (HDAC). Eles descobriram que aumentava a eficiência da reprogramação em 100 vezes (em comparação com o método do fator de transcrição tradicional de Yamanaka ). Os pesquisadores propuseram que este composto estava imitando a sinalização que geralmente é causada pelo fator de transcrição c-Myc. Um tipo semelhante de mecanismo de compensação foi proposto para imitar os efeitos do Sox2 . Em 2008, Ding et al. usaram a inibição da histona metil transferase (HMT) com BIX-01294 em combinação com a ativação dos canais de cálcio na membrana plasmática para aumentar a eficiência da reprogramação. Deng et al. da Universidade de Pequim relatou em julho de 2013 que as células-tronco pluripotentes induzidas podem ser criadas sem qualquer modificação genética. Eles usaram um coquetel de sete compostos de moléculas pequenas, incluindo DZNep, para induzir células somáticas de camundongo em células-tronco, que eles chamaram de células CiPS com a eficiência - de 0,2% - comparável àquelas que usam técnicas de produção iPSC padrão. As células CiPS foram introduzidas no desenvolvimento de embriões de camundongos e foram encontradas para contribuir com todos os principais tipos de células, provando sua pluripotência.

Ding et al. demonstraram uma alternativa à reprogramação do fator de transcrição por meio do uso de produtos químicos semelhantes a drogas. Ao estudar o processo MET ( transição mesenquimal-epitelial ) em que os fibroblastos são empurrados para um estado semelhante a células-tronco, o grupo de Ding identificou dois produtos químicos - inibidor de ALK5 SB431412 e inibidor de MEK (proteína quinase ativada por mitogênio) PD0325901 - que aumentou a eficiência do método genético clássico em 100 vezes. Adicionando um terceiro composto conhecido por estar envolvido na via de sobrevivência celular, a tiazovivina aumenta ainda mais a eficiência em 200 vezes. O uso da combinação desses três compostos também diminuiu o processo de reprogramação dos fibroblastos humanos de quatro para duas semanas.

Em abril de 2009, foi demonstrado que a geração de células iPS é possível sem qualquer alteração genética da célula adulta: um tratamento repetido das células com certas proteínas canalizadas para as células por meio de âncoras de poliarginina foi suficiente para induzir a pluripotência. A sigla dada para essas iPSCs é piPSCs (células-tronco pluripotentes induzidas por proteínas).

Vetores alternativos

Outra estratégia importante para evitar problemas como a gênese do tumor e o baixo rendimento tem sido o uso de formas alternativas de vetores: adenovírus , plasmídeos e DNA nu e / ou compostos de proteínas.

Em 2008, Hochedlinger et al. usou um adenovírus para transportar os quatro fatores de transcrição necessários para o DNA das células da pele e do fígado de camundongos, resultando em células idênticas às ESCs. O adenovírus é diferente de outros vetores, como vírus e retrovírus, porque não incorpora nenhum de seus próprios genes no hospedeiro-alvo e evita o potencial de mutagênese por inserção. Em 2009, Freed et al. demonstrou reprogramação bem-sucedida de fibroblastos humanos para células iPS. Outra vantagem de usar adenovírus é que eles só precisam se apresentar por um breve período de tempo para que ocorra uma reprogramação eficaz.

Também em 2008, Yamanaka et al. descobriram que eles poderiam transferir os quatro genes necessários com um plasmídeo. O grupo Yamanaka reprogramou com sucesso células de camundongo por transfecção com dois construtos de plasmídeo carregando os fatores de reprogramação; o primeiro plasmídeo expressou c-Myc, enquanto o segundo expressou os outros três fatores ( Oct4 , Klf4 e Sox2 ). Embora os métodos de plasmídeo evitem vírus, eles ainda requerem genes promotores de câncer para realizar a reprogramação. O outro problema principal com esses métodos é que eles tendem a ser muito menos eficientes em comparação com os métodos retrovirais. Além disso, foi demonstrado que os plasmídeos transfectados se integram ao genoma do hospedeiro e, portanto, ainda representam o risco de mutagênese por inserção. Como as abordagens não retrovirais demonstraram níveis de eficiência tão baixos, os pesquisadores tentaram resgatar efetivamente a técnica com o que é conhecido como Sistema de Transposon PiggyBac . Vários estudos demonstraram que este sistema pode entregar efetivamente os principais fatores de reprogramação sem deixar mutações de pegada no genoma da célula hospedeira. O PiggyBac Transposon System envolve a reexcisão de genes exógenos, o que elimina o problema de mutagênese de inserção.

Aquisição de células de pluripotência desencadeada por estímulo

Artigo principal: Aquisição de pluripotência desencadeada por estímulo

Em janeiro de 2014, dois artigos foram publicados afirmando que um tipo de célula-tronco pluripotente pode ser gerado submetendo as células a certos tipos de estresse (toxina bacteriana, um baixo pH de 5,7 ou compressão física); as células resultantes foram chamadas células STAP, para aquisição de pluripotência desencadeada por estímulo .

Diante das dificuldades que outros laboratórios tiveram para replicar os resultados do surpreendente estudo, em março de 2014, um dos coautores solicitou a retratação dos artigos. Em 4 de junho de 2014, a autora principal, Obokata , concordou em retirar ambos os documentos depois que ela foi considerada como tendo cometido 'má conduta de pesquisa', conforme concluído em uma investigação pela RIKEN em 1 de abril de 2014.

Moléculas de RNA

MicroRNAs são moléculas curtas de RNA que se ligam a sequências complementares no RNA mensageiro e bloqueiam a expressão de um gene. Medir variações na expressão de microRNA em células iPS pode ser usado para prever seu potencial de diferenciação. A adição de microRNAs também pode ser usada para aumentar o potencial de iPS. Vários mecanismos foram propostos. Moléculas de microRNA específicas de células ES (como miR-291, miR-294 e miR-295) aumentam a eficiência da pluripotência induzida agindo a jusante de c-Myc. Os microRNAs também podem bloquear a expressão de repressores dos quatro fatores de transcrição de Yamanaka, e pode haver mecanismos adicionais que induzem a reprogramação, mesmo na ausência de fatores de transcrição exógenos adicionados.

Identidade

Três células / tecidos da linha germinativa diferenciados de iPSCs: neurônios ( ectoderme ), cartilagem (osso mole, mesoderma ) e células caliciformes no intestino (endoderme).

As células-tronco pluripotentes induzidas são semelhantes às células-tronco pluripotentes naturais, como as células-tronco embrionárias (ES) , em muitos aspectos, como a expressão de certos genes e proteínas de células-tronco, padrões de metilação da cromatina , tempo de duplicação, formação de corpo embrioide , formação de teratoma , formação de quimera viável e potência e diferenciabilidade, mas a extensão total de sua relação com células-tronco pluripotentes naturais ainda está sendo avaliada.

A expressão gênica e H3K4me3 em todo o genoma e H3K27me3 foram considerados extremamente semelhantes entre as células ES e iPS. As iPSCs geradas foram notavelmente semelhantes às células-tronco pluripotentes isoladas naturalmente (como células-tronco embrionárias humanas e de camundongo , mESCs e hESCs, respectivamente) nos seguintes aspectos, confirmando assim a identidade, autenticidade e pluripotência das iPSCs para células-tronco pluripotentes isoladas naturalmente :

  • Propriedades biológicas celulares
    • Morfologia: as iPSCs foram morfologicamente semelhantes às ESCs. Cada célula tinha formato redondo, nucléolo grande e citoplasma escasso . As colônias de iPSCs também eram semelhantes às de ESCs. As iPSCs humanas formaram colônias de arestas afiadas, planas e compactamente compactadas semelhantes às hESCs e as iPSCs de camundongos formaram as colônias semelhantes às mESCs, colônias menos planas e mais agregadas do que as de hESCs.
    • Propriedades de crescimento: o tempo de duplicação e a atividade mitótica são os pilares das ESCs, pois as células-tronco devem se auto-renovar como parte de sua definição. As iPSCs foram mitoticamente ativas, ativamente se auto-renovando, proliferando e se dividindo a uma taxa igual às ESCs.
    • Marcadores de células-tronco: iPSCs expressos marcadores antigênicos de superfície celular expressos em ESCs. IPSCs humanos expressaram os marcadores específicos para hESC, incluindo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49 / 6E e Nanog. IPSCs de camundongo expressaram SSEA-1, mas não SSEA-3 nem SSEA-4, de forma semelhante aos mESCs.
    • Genes de células-tronco: genes expressos de iPSCs expressos em ESCs indiferenciados, incluindo Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 e hTERT.
    • Atividade da telomerase: as telomerases são necessárias para sustentar a divisão celular irrestrita pelo limite de Hayflick de ~ 50 divisões celulares. hESCs expressam alta atividade telomerase para sustentar a autorrenovação e proliferação, e iPSCs também demonstram alta atividade telomerase e expressam hTERT ( transcriptase reversa da telomerase humana ), um componente necessário no complexo da proteína telomerase.
  • Pluripotência: as iPSCs foram capazes de se diferenciar de maneira semelhante às ESCs em tecidos totalmente diferenciados.
    • Diferenciação neural: as iPSCs foram diferenciadas em neurônios , expressando βIII-tubulina, tirosina hidroxilase, AADC, DAT, ChAT, LMX1B e MAP2. A presença de enzimas associadas a catecolaminas pode indicar que iPSCs, como hESCs, podem ser diferenciáveis ​​em neurônios dopaminérgicos . Genes associados a células-tronco foram regulados para baixo após a diferenciação.
    • Diferenciação cardíaca: as iPSCs foram diferenciadas em cardiomiócitos que começaram a bater espontaneamente. Os cardiomiócitos expressaram TnTc, MEF2C, MYL2A, MYHCβ e NKX2.5. Genes associados a células-tronco foram regulados para baixo após a diferenciação.
    • Formação de teratoma : iPSCs injetados em camundongos imunodeficientes espontaneamente formaram teratomas após nove semanas. Teratomas são tumores de múltiplas linhagens contendo tecido derivado das três camadas germinativas endoderme , mesoderme e ectoderme ; isso é diferente de outros tumores, que normalmente são de apenas um tipo de célula. A formação de teratoma é um teste marcante para a pluripotência.
    • Corpo embrióide: hESCs em cultura espontaneamente formam estruturas semelhantes a embriões denominadas " corpos embrióides ", que consistem em um núcleo de hESCs mitoticamente ativos e diferenciadores e uma periferia de células totalmente diferenciadas de todas as três camadas germinativas. As iPSCs também formam corpos embrióides e possuem células diferenciadas periféricas.
    • Camundongos quiméricos: hESCs residem naturalmente dentro da massa celular interna ( embrioblasto ) dos blastocistos e, no embrioblasto, diferenciam-se no embrião enquanto a casca do blastocisto ( trofoblasto ) se diferencia em tecidos extraembrionários. O trofoblasto oco é incapaz de formar um embrião vivo e, portanto, é necessário que as células-tronco embrionárias dentro do embrioblasto se diferenciem e formem o embrião. As iPSCs foram injetadas por micropipeta em um trofoblasto e o blastocisto foi transferido para as fêmeas receptoras. Filhotes de camundongos vivos quiméricos foram criados: camundongos com derivados iPSC incorporados por todo o corpo com quimerismo de 10 a 90%.
    • Complementação tetraplóide : células iPS de fibroblastos fetais de camundongo injetadas em blastocistos tetraplóides (que só podem formar tecidos extra-embrionários) podem formar camundongos férteis inteiros, não quiméricos, embora com baixa taxa de sucesso.
  • Reprogramação epigenética
    • Desmetilação do promotor: a metilação é a transferência de um grupo metil para uma base de DNA, tipicamente a transferência de um grupo metil para uma molécula de citosina em um sítio CpG (seqüência adjacente de citosina / guanina). A metilação generalizada de um gene interfere na expressão , impedindo a atividade das proteínas de expressão ou recrutando enzimas que interferem na expressão. Assim, a metilação de um gene efetivamente o silencia, impedindo a transcrição. Promotores de genes associados à pluripotência, incluindo Oct-3/4, Rex1 e Nanog, foram desmetilados em iPSCs, demonstrando sua atividade promotora e a promoção ativa e expressão de genes associados à pluripotência em iPSCs.
    • Metilação do DNA globalmente: as células iPS humanas são muito semelhantes às células ES em seus padrões, em que as citosinas são metiladas , mais do que qualquer outro tipo de célula. No entanto, cerca de mil sites mostram diferenças em várias linhas de células iPS. Metade delas se assemelha à linha de células somáticas da qual as células iPS foram derivadas, o restante é específico para iPSC. Dezenas de regiões que são megabases em tamanho também foram encontradas onde as células iPS não são reprogramadas para o estado de célula ES.
    • Desmetilação das histonas : as histonas são proteínas compactadoras que estão estruturalmente localizadas em sequências de DNA que podem afetar sua atividade por meio de várias modificações relacionadas à cromatina. Histonas H3 associadas a Oct-3/4, Sox2 e Nanog foram desmetiladas, indicando a expressão de Oct-3/4, Sox2 e Nanog.

Segurança

  • A principal preocupação com a aplicação clínica potencial de iPSCs é sua propensão para formar tumores. Muito parecido com as ESC, as iPSCs prontamente formam teratoma quando injetadas em camundongos imunodeficientes. A formação de teratoma é considerada um grande obstáculo para a medicina regenerativa baseada em células-tronco pelo FDA.
  • Um estudo mais recente sobre a recuperação funcional motora após lesões da medula espinhal em camundongos mostrou que, após o transplante de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, as células se diferenciaram em três linhagens neurais na medula espinhal. As células estimularam o crescimento da medula espinhal danificada, mantiveram a mielinização e formaram sinapses. Esses resultados positivos foram observados por mais de 112 dias após a lesão medular, sem formação de tumor. No entanto, um estudo de acompanhamento pelo mesmo grupo mostrou clones distintos de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que eventualmente formaram tumores.
  • Uma vez que as iPSCs só podem ser produzidas com alta eficiência neste momento usando modificações, geralmente se prevê que elas sejam menos seguras e mais tumorigênicas do que as hESC. Todos os genes que comprovadamente promovem a formação de iPSC também foram associados ao câncer de uma forma ou de outra. Alguns dos genes são oncogenes conhecidos, incluindo os membros da família Myc. Embora omitir Myc ainda permita a formação de IPSC, a eficiência é reduzida em até 100 vezes.
  • Um método não genético de produção de iPSCs foi demonstrado usando proteínas recombinantes, mas sua eficiência era bastante baixa. No entanto, refinamentos a esta metodologia rendendo maior eficiência podem levar à produção de iPSCs mais seguros. Outras abordagens, como o uso de adenovírus ou plasmídeos, são geralmente consideradas mais seguras do que os métodos retrovirais.
  • Uma área importante para estudos futuros no campo iPSC é testar diretamente a tumorigenicidade iPSC usando métodos que imitam as abordagens que seriam usadas para terapias de medicina regenerativa. Esses estudos são cruciais, pois as iPSCs não apenas formam teratoma, mas também os camundongos derivados de iPSCs têm uma alta incidência de morte por câncer maligno. Um artigo de 2010 foi publicado na revista Stem Cells indicando que as células iPS são muito mais tumorigênicas do que ESC, apoiando a noção de que a segurança das células iPS é uma preocupação séria.
  • A preocupação com a imunogenicidade das células IPS surgiu em 2011, quando Zhou et al. realizaram um estudo envolvendo um ensaio de formação de teratoma e demonstraram que as células IPS produziram uma resposta imune forte o suficiente para causar a rejeição das células. Quando um procedimento semelhante foi realizado em células ES geneticamente equivalentes, Zhou et al. encontraram teratomas , que indicavam que as células eram toleradas pelo sistema imunológico. Em 2013, Araki et al. tentou reproduzir a conclusão obtida por Zhou et al. usando um procedimento diferente. Eles pegaram células de uma quimera que havia sido cultivada a partir de clones de IPSC e um embrião de camundongo, este tecido foi então transplantado em camundongos singênicos . Eles conduziram um teste semelhante usando células ES em vez do clone IPSC e compararam os resultados. Os resultados indicam que não houve diferença significativa na resposta imunogênica produzida pelas células IPS e células ES. Além disso, Araki et al. relataram pouca ou nenhuma resposta imunogênica para ambas as linhas de células. Assim, Araki et al. não foi capaz de chegar à mesma conclusão que Zhou et al.

Realizações recentes e tarefas futuras para terapia celular segura baseada em iPSC são coletadas na revisão de Okano et al.

Pesquisa médica

A tarefa de produzir células iPS continua sendo um desafio devido aos seis problemas mencionados acima. Um dilema fundamental a ser superado é aquele entre eficiência e integração genômica. A maioria dos métodos que não dependem da integração de transgenes são ineficientes, enquanto aqueles que dependem da integração de transgenes enfrentam problemas de reprogramação incompleta e gênese tumoral, embora um grande número de técnicas e métodos tenham sido tentados. Outro grande conjunto de estratégias é realizar uma caracterização proteômica de células iPS. Novos estudos e novas estratégias devem gerar soluções ótimas para os cinco desafios principais. Uma abordagem pode tentar combinar os atributos positivos dessas estratégias em uma técnica eficaz para reprogramar células em células iPS.

Outra abordagem é o uso de células iPS derivadas de pacientes para identificar drogas terapêuticas capazes de resgatar um fenótipo. Por exemplo, as linhas de células iPS derivadas de pacientes afetados pela síndrome de displasia ectodérmica (EEC), em que o gene p63 está mutado, exibem comprometimento epitelial anormal que poderia ser parcialmente resgatado por um pequeno composto.

Modelagem de doenças e desenvolvimento de medicamentos

Uma característica atraente das células iPS humanas é a capacidade de derivá-las de pacientes adultos para estudar a base celular da doença humana. Como as células iPS são autorrenováveis ​​e pluripotentes, elas representam uma fonte teoricamente ilimitada de células derivadas de pacientes que podem ser transformadas em qualquer tipo de célula do corpo. Isso é particularmente importante porque muitos outros tipos de células humanas derivadas de pacientes tendem a parar de crescer após algumas passagens em cultura de laboratório. As células iPS foram geradas para uma ampla variedade de doenças genéticas humanas, incluindo distúrbios comuns como a síndrome de Down e doença renal policística. Em muitos casos, as células iPS derivadas de pacientes exibem defeitos celulares não observados em células iPS de pacientes saudáveis, fornecendo uma visão sobre a fisiopatologia da doença. Um projeto colaborativo internacional, StemBANCC, foi formado em 2012 para construir uma coleção de linhas de células iPS para rastreamento de drogas para uma variedade de doenças. Gerenciado pela Universidade de Oxford , o esforço reuniu fundos e recursos de 10 empresas farmacêuticas e 23 universidades. O objetivo é gerar uma biblioteca de 1.500 linhas de células iPS que serão usadas em testes iniciais de drogas, fornecendo um ambiente simulado de doenças humanas. Além disso, a combinação de tecnologia hiPSC e indicadores geneticamente codificados de voltagem e cálcio proporcionou uma plataforma de grande escala e alto rendimento para triagem de segurança de drogas cardiovasculares.

Síntese de órgãos

Uma prova de conceito do uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para gerar órgãos humanos para transplante foi relatada por pesquisadores japoneses. Os ' botões do fígado ' humanos (iPSC-LBs) foram cultivados a partir de uma mistura de três tipos diferentes de células-tronco: hepatócitos (para a função hepática) obtidos a partir de iPSCs; células-tronco endoteliais (para formar o revestimento dos vasos sanguíneos ) do sangue do cordão umbilical ; e células-tronco mesenquimais (para formar tecido conjuntivo ). Esta nova abordagem permite que diferentes tipos de células se auto-organizem em um órgão complexo, imitando o processo de desenvolvimento fetal . Depois de crescer in vitro por alguns dias, os botões do fígado foram transplantados para camundongos, onde o "fígado" rapidamente se conectou aos vasos sanguíneos do hospedeiro e continuou a crescer. Mais importante ainda, desempenhava funções hepáticas regulares, incluindo o metabolismo de drogas e a produção de proteínas específicas do fígado. Novos estudos irão monitorar a longevidade do órgão transplantado no corpo do hospedeiro (capacidade de se integrar ou evitar a rejeição ) e se ele irá se transformar em tumores . Usando esse método, células de um camundongo poderiam ser usadas para testar 1.000 compostos de drogas para tratar doenças do fígado e reduzir o uso de animais em até 50.000.

Reparo de tecido

Células do cordão umbilical foram induzidas em células-tronco pluripotentes usando DNA de plasmídeo. Usando marcadores endoteliais / pericíticos da superfície celular CD31 e CD146 , os pesquisadores identificaram 'progenitor vascular', as células-tronco vasculares multipotentes de alta qualidade. Depois que as células iPS foram injetadas diretamente no vítreo da retina danificada de camundongos, as células-tronco enxertadas na retina, cresceram e repararam os vasos vasculares .

NSCs derivados de iPSCs marcados injetados em animais de laboratório com lesões cerebrais foram mostrados para migrar para as lesões e alguma melhora da função motora foi observada.

Cardiomiócitos

Células do músculo cardíaco pulsantes, cardiomiócitos derivados de iPSC , podem ser produzidas em massa usando protocolos de diferenciação quimicamente definidos. Esses protocolos normalmente modulam as mesmas vias de sinalização de desenvolvimento necessárias para o desenvolvimento do coração . Esses cardiomiócitos iPSC podem recapitular arritmias genéticas e respostas a medicamentos cardíacos, uma vez que exibem o mesmo fundo genético do paciente do qual foram derivados.

Em junho de 2014, a Takara Bio recebeu transferência de tecnologia da iHeart Japan, uma empresa de risco do Instituto de Pesquisa de Células iPS da Universidade de Kyoto, para tornar possível o uso exclusivo de tecnologias e patentes que induzem a diferenciação de células iPS em cardiomiócitos na Ásia. A empresa anunciou a ideia de vender cardiomiócitos a empresas farmacêuticas e universidades para ajudar a desenvolver novos medicamentos para doenças cardíacas.

Em 9 de março de 2018, o Comitê de Medicina Regenerativa Especificada da Universidade de Osaka aprovou oficialmente o primeiro plano de pesquisa clínica do mundo para transplantar uma “folha de miocárdio” feita de células iPS no coração de pacientes com insuficiência cardíaca grave. A Universidade de Osaka anunciou que havia entrado com um pedido no Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar no mesmo dia.

Em 16 de maio de 2018, o plano de pesquisa clínica foi aprovado pelo grupo de especialistas do Ministério da Saúde, Trabalho e Previdência com a doença.

Em outubro de 2019, um grupo da Universidade de Okayama desenvolveu um modelo de doença isquêmica do coração usando cardiomiócitos diferenciados de células iPS.

glóbulos vermelhos

Embora meio litro de sangue doado contenha cerca de dois trilhões de glóbulos vermelhos e mais de 107 milhões de doações de sangue sejam coletadas globalmente, ainda há uma necessidade crítica de sangue para transfusão. Em 2014, os glóbulos vermelhos do tipo O foram sintetizados no Serviço Nacional de Transfusão de Sangue Escocês da iPSC. As células foram induzidas a se tornarem um mesoderma e, em seguida, células sanguíneas e, em seguida, células vermelhas do sangue. A etapa final foi fazê-los ejetar seus núcleos e amadurecer adequadamente. O tipo O pode ser transfundido em todos os pacientes. Os ensaios clínicos em humanos não eram esperados para começar antes de 2016.

Ensaio clínico

O primeiro ensaio clínico em humanos usando iPSCs autólogos foi aprovado pelo Ministério da Saúde do Japão e deveria ser realizado em 2014 no Riken Center for Developmental Biology em Kobe . No entanto, o teste foi suspenso depois que as novas leis de medicina regenerativa do Japão entraram em vigor em novembro de 2015. Mais especificamente, um conjunto existente de diretrizes foi reforçado para ter força de lei (anteriormente meras recomendações). As iPSCs derivadas de células da pele de seis pacientes que sofrem de degeneração macular relacionada à idade úmida foram reprogramadas para se diferenciar em células epiteliais pigmentares da retina (RPE) . A folha de células seria transplantada para a retina afetada, onde o tecido RPE degenerado foi excisado. O monitoramento da segurança e da restauração da visão duraria de um a três anos.

Em março de 2017, uma equipe liderada por Masayo Takahashi concluiu o primeiro transplante bem-sucedido de células retinais derivadas de iPS de um doador para o olho de uma pessoa com degeneração macular avançada. No entanto, foi relatado que agora eles estão tendo complicações. Os benefícios de usar iPSCs autólogos são que teoricamente não há risco de rejeição e que elimina a necessidade de usar células-tronco embrionárias . No entanto, esses iPSCs foram derivados de outra pessoa.

Novos ensaios clínicos envolvendo IPSCs estão em andamento não apenas no Japão, mas também nos Estados Unidos e na Europa. A pesquisa em 2021 no registro de estudos Clinicaltrials.gov identificou 129 listas de estudos mencionando IPSCs, mas a maioria era não intervencionista.

Estratégia para obter iPSCs universais

Para tornar as tecnologias de medicina regenerativa baseadas em iPSC disponíveis para mais pacientes, é necessário criar iPSCs universais que podem ser transplantados independentemente dos haplótipos de HLA . A estratégia atual para a criação de iPSCs universais tem dois objetivos principais: remover a expressão de HLA e prevenir ataques de células NK devido à deleção de HLA. Foi relatado que a deleção dos genes B2M e CIITA usando o sistema CRISPR / Cas9 suprime a expressão de HLA classe I e classe II, respectivamente. Para evitar ataques de células NK. transdução de ligantes que inibem células NK, como HLA-E e CD47, tem sido usada. O HLA-C permanece inalterado, uma vez que os 12 alelos HLA-C comuns são suficientes para cobrir 95% da população mundial.

Propriedades anti-envelhecimento

Uma célula-tronco mesenquimal multipotente, quando induzida à pluripotência, é uma grande promessa para retardar ou reverter os fenótipos do envelhecimento. Essas propriedades anti-envelhecimento foram demonstradas nos primeiros ensaios clínicos em 2017. Em 2020, pesquisadores da Universidade de Stanford concluíram, após estudar ratos idosos, que células humanas velhas, quando submetidas aos fatores de Yamanaka, podem rejuvenescer e se tornar quase indistinguíveis de suas contrapartes mais jovens.

Veja também

Referências

links externos