Metilação de DNA - DNA methylation

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Representação de uma molécula de DNA que é metilada. As duas esferas brancas representam grupos metil . Eles estão ligados a duas moléculas de nucleotídeos de citosina que compõem a sequência de DNA.

A metilação do DNA é um processo biológico pelo qual grupos metil são adicionados à molécula de DNA . A metilação pode alterar a atividade de um segmento de DNA sem alterar a sequência. Quando localizada em um promotor de gene , a metilação do DNA normalmente atua para reprimir a transcrição do gene . Em mamíferos, a metilação do DNA é essencial para o desenvolvimento normal e está associada a vários processos-chave, incluindo impressão genômica , inativação do cromossomo X , repressão de elementos transponíveis , envelhecimento e carcinogênese .

Em 2016, foram encontradas duas nucleobases nas quais ocorre a metilação enzimática natural do DNA: adenina e citosina . As bases modificadas são N 6 -methyladenine, 5-metilcitosina e N 4 -methylcytosine.

Base não modificada Adenin.svg   Cytosin.svg
  Adenina,  A   Citosina,  C
Formulários modificados 6-metiladenina.svg 5-Metilcitosina.svg N4-Metilcitosina.svg
  N 6 -Methyladenine,  6 mA   5-Metilcitosina,  5mC   N 4 -metilcitosina4mC

Duas das quatro bases do DNA, citosina e adenina , podem ser metiladas. A metilação da citosina é comum em eucariotos e procariotos , embora a taxa de metilação do DNA da citosina possa diferir muito entre as espécies: 14% das citosinas são metiladas em Arabidopsis thaliana , 4% a 8% em Physarum , 7,6% em Mus musculus , 2,3% em Escherichia coli , 0,03% em Drosophila , 0,006% em Dictyostelium e virtualmente nenhum (0,0002 a 0,0003%) em Caenorhabditis ou fungos como Saccharomyces cerevisiae e S. pombe (mas não N. crassa ). A metilação da adenina foi observada em bactérias, plantas e, recentemente, no DNA de mamíferos, mas recebeu consideravelmente menos atenção.

A metilação da citosina para formar 5-metilcitosina ocorre na mesma posição 5 no anel de pirimidina onde o grupo metil da timina de base de DNA está localizado; a mesma posição distingue a timina do uracila- base de RNA análogo , que não possui grupo metil. A desaminação espontânea da 5-metilcitosina converte-a em timina. Isso resulta em uma incompatibilidade T: G. Mecanismos de reparo, em seguida, corrija-o de volta ao par C: G original; alternativamente, eles podem substituir A por G, transformando o par C: G original em um par T: A, efetivamente mudando uma base e introduzindo uma mutação. Esta base incorporada incorretamente não será corrigida durante a replicação do DNA, pois a timina é uma base do DNA. Se a incompatibilidade não for reparada e a célula entrar no ciclo celular, a fita que carrega o T será complementada por um A em uma das células-filhas, de modo que a mutação se torne permanente. O uso quase universal da timina exclusivamente no DNA e do uracila exclusivamente no RNA pode ter evoluído como um mecanismo de controle de erros, para facilitar a remoção dos uracilos gerados pela desaminação espontânea da citosina. A metilação do DNA, bem como muitas de suas DNA metiltransferases contemporâneas, foram pensadas para evoluir a partir da atividade de metilação do RNA primitiva do mundo primitivo e é apoiada por várias linhas de evidência.

Em plantas e outros organismos, a metilação do DNA é encontrada em três contextos de sequência diferentes: CG (ou CpG ), CHG ou CHH (onde H corresponde a A, T ou C). Em mamíferos, no entanto, a metilação do DNA é quase exclusivamente encontrada em dinucleotídeos CpG, com as citosinas em ambas as fitas sendo geralmente metiladas. A metilação não-CpG pode, entretanto, ser observada em células- tronco embrionárias , e também tem sido indicada no desenvolvimento neural . Além disso, a metilação não-CpG também foi observada em células progenitoras hematopoiéticas e ocorreu principalmente em um contexto de sequência CpApC.

Função conservada da metilação do DNA

Paisagem típica de metilação de DNA em mamíferos

A paisagem de metilação do DNA dos vertebrados é muito particular em comparação com outros organismos. Em mamíferos, cerca de 75% dos dinucleotídeos CpG são metilados em células somáticas , e a metilação do DNA aparece como um estado padrão que deve ser excluído especificamente de locais definidos. Em contraste, o genoma da maioria das plantas, invertebrados, fungos ou protistas mostra padrões de metilação em "mosaico", onde apenas elementos genômicos específicos são direcionados, e eles são caracterizados pela alternância de domínios metilados e não metilados.

A metilação CpG alta em genomas de mamíferos tem um custo evolutivo porque aumenta a frequência de mutações espontâneas. A perda de grupos amino ocorre com alta frequência para as citosinas, com consequências diferentes dependendo de sua metilação. Os resíduos C metilados desaminam espontaneamente para formar resíduos T ao longo do tempo; portanto, os dinucleotídeos CpG desaminam continuamente em dinucleotídeos TpG, o que é evidenciado pela sub-representação dos dinucleotídeos CpG no genoma humano (eles ocorrem em apenas 21% da frequência esperada). (Por outro lado, a desaminação espontânea de resíduos C não metilados dá origem a resíduos U, uma mudança que é rapidamente reconhecida e reparada pela célula.)

Ilhas CpG

Em mamíferos, a única exceção para esta depleção global de CpG reside em uma categoria específica de sequências ricas em GC e CpG denominadas ilhas CpG que são geralmente não metiladas e, portanto, retêm o conteúdo de CpG esperado. As ilhas CpG são geralmente definidas como regiões com: 1) um comprimento maior que 200 bp, 2) um conteúdo de G + C maior que 50%, 3) uma razão entre CpG observado e esperado maior que 0,6, embora outras definições às vezes sejam usadas. Excluindo as sequências repetidas, existem cerca de 25.000 ilhas CpG no genoma humano, 75% das quais têm menos de 850 pb de comprimento. Eles são as principais unidades regulatórias e cerca de 50% das ilhas CpG estão localizadas em regiões promotoras de genes, enquanto outros 25% estão em corpos gênicos, muitas vezes servindo como promotores alternativos. Reciprocamente, cerca de 60-70% dos genes humanos têm uma ilha CpG em sua região promotora. A maioria das ilhas CpG são constitutivamente não metiladas e enriquecidas para modificação permissiva da cromatina , como a metilação de H3K4. Nos tecidos somáticos, apenas 10% das ilhas CpG são metiladas, a maioria delas localizadas em regiões intergênicas e intragênicas.

Repressão de promotores CpG-densos

A metilação do DNA provavelmente estava presente em alguma extensão em ancestrais eucariotos muito antigos. Em praticamente todos os organismos analisados, a metilação nas regiões promotoras se correlaciona negativamente com a expressão do gene. Os promotores CpG-densos de genes ativamente transcritos nunca são metilados, mas, reciprocamente, os genes transcricionalmente silenciosos não carregam necessariamente um promotor metilado. Em camundongos e humanos, cerca de 60-70% dos genes têm uma ilha CpG em sua região promotora e a maioria dessas ilhas CpG permanece não metilada, independentemente da atividade transcricional do gene, em ambos os tipos de células diferenciadas e indiferenciadas. Digno de nota, enquanto a metilação do DNA das ilhas CpG está inequivocamente ligada à repressão transcricional, a função da metilação do DNA em promotores pobres em CG permanece obscura; embora haja poucas evidências de que possa ser funcionalmente relevante.

A metilação do DNA pode afetar a transcrição de genes de duas maneiras. Primeiro, a metilação do próprio DNA pode impedir fisicamente a ligação de proteínas transcricionais ao gene e, segundo, e provavelmente mais importante, o DNA metilado pode ser ligado por proteínas conhecidas como proteínas de domínio de ligação de metil-CpG (MBDs). As proteínas MBD então recrutam proteínas adicionais para o locus, como as histonas desacetilases e outras proteínas de remodelação da cromatina que podem modificar as histonas , formando assim uma cromatina compacta inativa, denominada heterocromatina . Esta ligação entre a metilação do DNA e a estrutura da cromatina é muito importante. Em particular, a perda da proteína 2 de ligação ao metil-CpG (MeCP2) foi implicada na síndrome de Rett ; e a proteína 2 do domínio de ligação ao metil-CpG (MBD2) medeia o silenciamento da transcrição de genes hipermetilados no "câncer".

Repressão de elementos transponíveis

A metilação do DNA é um poderoso repressor transcricional, pelo menos em contextos CpG densos. A repressão transcricional de genes codificadores de proteínas parece essencialmente limitada a classes muito específicas de genes que precisam ser silenciosos permanentemente e em quase todos os tecidos. Embora a metilação do DNA não tenha a flexibilidade necessária para o ajuste fino da regulação gênica, sua estabilidade é perfeita para garantir o silenciamento permanente dos elementos transponíveis . O controle do transposon é uma das funções mais antigas da metilação do DNA, compartilhada por animais, plantas e vários protistas. É até sugerido que a metilação do DNA evoluiu precisamente para esse propósito.

Expansão do genoma

Sabe-se que a metilação do DNA de elementos transponíveis está relacionada à expansão do genoma. No entanto, o driver evolutivo para a expansão do genoma permanece desconhecido. Existe uma correlação clara entre o tamanho do genoma e o CpG, sugerindo que a metilação do DNA dos elementos transponíveis levou a um aumento perceptível na massa do DNA.

Metilação do corpo gênico de genes altamente transcritos

Uma função que parece ainda mais conservada do que o silenciamento do transposon está positivamente correlacionada com a expressão do gene. Em quase todas as espécies onde a metilação do DNA está presente, a metilação do DNA é especialmente enriquecida no corpo de genes altamente transcritos. A função da metilação do corpo gênico não é bem compreendida. Um conjunto de evidências sugere que ele pode regular o splicing e suprimir a atividade de unidades transcricionais intragênicas (promotores crípticos ou elementos transponíveis). A metilação do corpo gênico parece intimamente ligada à metilação do H3K36. Em leveduras e mamíferos, a metilação de H3K36 é altamente enriquecida no corpo de genes altamente transcritos. Em levedura, pelo menos, o H3K36me3 recruta enzimas, como as histonas desacetilases, para condensar a cromatina e prevenir a ativação de locais crípticos de início. Em mamíferos, o domínio DNMT3a e DNMT3b PWWP se liga a H3K36me3 e as duas enzimas são recrutadas para o corpo de genes ativamente transcritos.

Em mamíferos

Dinâmica da metilação do DNA durante o desenvolvimento embrionário de camundongos. E3.5-E6, etc., referem-se aos dias após a fertilização. PGC: células germinativas primordiais

Durante o desenvolvimento embrionário

Os padrões de metilação do DNA são amplamente apagados e então restabelecidos entre as gerações nos mamíferos. Quase todas as metilação dos pais são apagadas, primeiro durante a gametogênese e novamente no início da embriogênese , com desmetilação e remetilação ocorrendo a cada vez. A desmetilação no início da embriogênese ocorre no período pré-implantação em dois estágios - inicialmente no zigoto , depois durante os primeiros poucos ciclos de replicação embrionária de mórula e blástula . Uma onda de metilação ocorre então durante o estágio de implantação do embrião, com ilhas CpG protegidas da metilação. Isso resulta em repressão global e permite que genes de manutenção sejam expressos em todas as células. No estágio pós-implantação, os padrões de metilação são específicos do estágio e do tecido, com mudanças que definiriam cada tipo de célula individual com duração estável por um longo período.

Considerando que a metilação do DNA não é necessária per se para o silenciamento da transcrição, acredita-se, no entanto, que represente um estado “bloqueado” que definitivamente inativa a transcrição. Em particular, a metilação do DNA parece crítica para a manutenção de silenciamento mono-alélica no contexto da impressão genómica e X inactivação do cromossoma . Nestes casos, os alelos expressos e silenciosos diferem pelo seu estado de metilação, e a perda de metilação do DNA resulta em perda de impressão e re-expressão de Xist em células somáticas. Durante o desenvolvimento embrionário, poucos genes mudam seu estado de metilação, com a importante exceção de muitos genes expressos especificamente na linha germinativa. A metilação do DNA parece absolutamente necessária em células diferenciadas , pois o nocaute de qualquer uma das três DNA metiltransferase competentes resulta em letalidade embrionária ou pós-parto. Em contraste, a metilação do DNA é dispensável em tipos de células indiferenciadas, como a massa celular interna do blastocisto, células germinativas primordiais ou células-tronco embrionárias. Uma vez que a metilação do DNA parece regular diretamente apenas um número limitado de genes, com que precisão a ausência da metilação do DNA causa a morte de células diferenciadas permanece uma questão em aberto.

Devido ao fenômeno do imprinting genômico , os genomas materno e paterno são diferenciados e devem ser adequadamente reprogramados toda vez que passam pela linha germinativa. Portanto, durante a gametogênese , as células germinativas primordiais devem ter seus padrões de metilação do DNA biparental original apagados e restabelecidos com base no sexo do pai transmissor. Após a fertilização, os genomas paterno e materno são novamente desmetilados e remetilados (exceto para regiões diferencialmente metiladas associadas a genes impressos). Essa reprogramação é provavelmente necessária para a totipotência do embrião recém-formado e o apagamento das alterações epigenéticas adquiridas.

Em câncer

Em muitos processos de doença, como o câncer , as ilhas CpG do promotor do gene adquirem hipermetilação anormal, o que resulta em silenciamento transcricional que pode ser herdado por células-filhas após a divisão celular. Alterações na metilação do DNA foram reconhecidas como um importante componente do desenvolvimento do câncer. A hipometilação, em geral, surge mais cedo e está ligada à instabilidade cromossômica e perda de impressão, enquanto a hipermetilação está associada a promotores e pode surgir secundária ao silenciamento do gene (supressor de oncogene), mas pode ser um alvo para terapia epigenética .

A hipometilação global também tem sido implicada no desenvolvimento e progressão do câncer por meio de diferentes mecanismos. Normalmente, há hipermetilação de genes supressores de tumor e hipometilação de oncogenes .

Geralmente, na progressão para o câncer, centenas de genes são silenciados ou ativados . Embora o silenciamento de alguns genes em cânceres ocorra por mutação, uma grande proporção do silenciamento de genes carcinogênicos é resultado da metilação alterada do DNA (ver metilação do DNA no câncer ). A metilação do DNA que causa silenciamento no câncer normalmente ocorre em vários locais CpG nas ilhas CpG que estão presentes nos promotores de genes que codificam proteínas.

Expressões alteradas de microRNAs também silenciam ou ativam muitos genes em progressão para o câncer (ver microRNAs no câncer ). MicroARN expressão alterada ocorre através hiper / hipo-metilação dos locais de CpG em ilhas CpG em promotores que controlam a transcrição dos microARNs .

O silenciamento de genes de reparo de DNA por meio da metilação de ilhas CpG em seus promotores parece ser especialmente importante na progressão para o câncer (ver metilação de genes de reparo de DNA no câncer ).

Na aterosclerose

Modificações epigenéticas, como a metilação do DNA, têm sido implicadas em doenças cardiovasculares, incluindo aterosclerose . Em modelos animais de aterosclerose, o tecido vascular, bem como as células sanguíneas, como as células mononucleares do sangue, exibem hipometilação global com áreas de hipermetilação específicas do gene. Polimorfismos de metilação de DNA podem ser usados ​​como um biomarcador precoce de aterosclerose, uma vez que estão presentes antes que as lesões sejam observadas, o que pode fornecer uma ferramenta precoce para detecção e prevenção de risco.

Dois dos tipos de células direcionados aos polimorfismos de metilação do DNA são monócitos e linfócitos, que sofrem uma hipometilação geral. Um mecanismo proposto por trás dessa hipometilação global são os níveis elevados de homocisteína causando hiper-homocisteinemia , um conhecido fator de risco para doenças cardiovasculares. Altos níveis plasmáticos de homocisteína inibem as metiltransferases de DNA, que causam hipometilação. A hipometilação do DNA afeta os genes que alteram a proliferação das células musculares lisas, causam disfunção das células endoteliais e aumentam os mediadores inflamatórios, todos críticos na formação de lesões ateroscleróticas. Altos níveis de homocisteína também resultam na hipermetilação das ilhas CpG na região promotora do gene do receptor alfa de estrogênio (ERα), causando sua regulação negativa. O ERα protege contra a aterosclerose devido à sua ação como supressor de crescimento, fazendo com que as células musculares lisas permaneçam em estado de repouso. A hipermetilação do promotor ERα permite assim que as células do músculo liso da íntima proliferem excessivamente e contribuam para o desenvolvimento da lesão aterosclerótica.

Outro gene que experimenta uma mudança no estado de metilação na aterosclerose é o transportador de monocarboxilato (MCT3), que produz uma proteína responsável pelo transporte de lactato e outros corpos cetônicos de muitos tipos de células, incluindo células do músculo liso vascular. Em pacientes com aterosclerose, há um aumento na metilação das ilhas CpG no exon 2, o que diminui a expressão da proteína MCT3. A regulação negativa de MCT3 prejudica o transporte de lactato e aumenta significativamente a proliferação de células do músculo liso, o que contribui ainda mais para a lesão aterosclerótica. Um experimento ex vivo usando o agente desmetilante Decitabina (5-aza-2-desoxicitidina) mostrou induzir a expressão de MCT3 de uma maneira dependente da dose, uma vez que todos os locais hipermetilados na ilha CpG do exon 2 tornaram-se desmetilados após o tratamento. Isso pode servir como um novo agente terapêutico para tratar a aterosclerose, embora nenhum estudo em humanos tenha sido realizado até agora.

Na insuficiência cardíaca

Além da aterosclerose descrita acima, alterações epigenéticas específicas foram identificadas no coração humano com insuficiência. Isso pode variar de acordo com a etiologia da doença. Por exemplo, na insuficiência cardíaca isquêmica, as alterações na metilação do DNA têm sido associadas a mudanças na expressão gênica que podem direcionar a expressão gênica associada às alterações no metabolismo cardíaco que se sabe que ocorrem. Formas adicionais de insuficiência cardíaca (por exemplo, cardiomiopatia diabética) e comorbidades (por exemplo, obesidade) devem ser exploradas para ver o quão comuns são esses mecanismos. O mais impressionante é que, na insuficiência cardíaca humana, essas mudanças na metilação do DNA estão associadas ao status racial e socioeconômico, que impactam ainda mais como a expressão gênica é alterada e podem influenciar como a insuficiência cardíaca do indivíduo deve ser tratada.

No envelhecimento

Em humanos e outros mamíferos, os níveis de metilação do DNA podem ser usados ​​para estimar com precisão a idade dos tecidos e tipos de células, formando um relógio epigenético preciso .

Um estudo longitudinal de gêmeos crianças mostrou que, entre as idades de 5 e 10, houve divergência de padrões de metilação devido a influências ambientais, em vez de genéticos. Há uma perda global de metilação do DNA durante o envelhecimento.

Em um estudo que analisou o DNA completo dos metilomas de células T CD4 + em um recém-nascido, um indivíduo de 26 anos e um indivíduo de 103 anos observaram que a perda de metilação é proporcional à idade. Os CpGs hipometilados observados nos DNAs centenários em comparação com os neonatos cobriram todos os compartimentos genômicos (promotores, regiões intergênicas, intrônicas e exônicas). No entanto, alguns genes tornam-se hipermetilados com a idade, incluindo genes para o receptor de estrogênio , p16 e fator de crescimento semelhante à insulina 2 .

Em exercício

Foi demonstrado que exercícios de alta intensidade resultam em redução da metilação do DNA no músculo esquelético. A metilação do promotor de PGC-1α e PDK4 foi reduzida imediatamente após o exercício de alta intensidade, enquanto a metilação do PPAR-γ não foi reduzida até três horas após o exercício. Ao mesmo tempo, seis meses de exercícios em homens de meia-idade previamente sedentários resultaram em aumento da metilação no tecido adiposo . Um estudo mostrou um possível aumento na metilação do DNA genômico global de células brancas do sangue com mais atividade física em não hispânicos.

Na diferenciação de células B

Um estudo que investigou o metiloma das células B ao longo de seu ciclo de diferenciação, usando o sequenciamento de bissulfito do genoma inteiro (WGBS), mostrou que há uma hipometilação dos estágios iniciais aos mais diferenciados. A maior diferença de metilação está entre os estágios das células B do centro germinativo e as células B de memória. Além disso, este estudo mostrou que há uma semelhança entre os tumores de células B e as células B de vida longa em suas assinaturas de metilação do DNA.

No cérebro

Duas revisões resumem as evidências de que as alterações de metilação do DNA nos neurônios do cérebro são importantes para o aprendizado e a memória. O condicionamento contextual do medo (uma forma de aprendizagem associativa) em animais, como camundongos e ratos, é rápido e extremamente robusto na criação de memórias. Em camundongos e ratos, o condicionamento contextual do medo, dentro de 1–24 horas, está associado a metilação alterada de vários milhares de citosinas de DNA em genes de neurônios do hipocampo . Vinte e quatro horas após o condicionamento contextual do medo, 9,2% dos genes nos neurônios do hipocampo de rato são diferencialmente metilados. Em camundongos, quando examinados quatro semanas após o condicionamento, as metilações e desmetilações do hipocampo foram restauradas às condições originais. O hipocampo é necessário para formar memórias, mas as memórias não são armazenadas nele. Para esses camundongos, quatro semanas após o condicionamento contextual do medo, ocorreram metilação e desmetilação diferenciais substanciais de CpG nos neurônios corticais durante a manutenção da memória, e havia 1.223 genes diferencialmente metilados em seu córtex cingulado anterior. Mudanças ativas na metilação e desmetilação do DNA neuronal parecem agir como controladores da escala sináptica e do tráfego do receptor de glutamato na aprendizagem e na formação da memória .

Metiltransferases de DNA (em mamíferos)

Possíveis vias de metilação e desmetilação da citosina. Abreviaturas: S-Adenosil-L-homocisteína ( SAH ), S-adenosil-L-metionina ( SAM ), DNA metiltransferase ( DNA MTase ), Uracil -DNA glicosilase ( UNG )

Em células de mamíferos, a metilação do DNA ocorre principalmente na posição C5 dos dinucleotídeos CpG e é realizada por duas classes gerais de atividades enzimáticas - metilação de manutenção e metilação de novo .

A atividade de metilação de manutenção é necessária para preservar a metilação do DNA após cada ciclo de replicação do DNA celular. Sem a DNA metiltransferase (DNMT), a própria máquina de replicação produziria fitas filhas que não são metiladas e, com o tempo, levariam à desmetilação passiva. DNMT1 é a metiltransferase de manutenção proposta que é responsável por copiar os padrões de metilação do DNA para as fitas filhas durante a replicação do DNA. Os modelos de camundongos com ambas as cópias de DNMT1 excluídas são letais embrionárias aproximadamente no dia 9, devido à necessidade de atividade de DNMT1 para o desenvolvimento em células de mamíferos.

Pensa-se que DNMT3a e DNMT3b são as metiltransferases de novo que configuram padrões de metilação do DNA no início do desenvolvimento. DNMT3L é uma proteína homóloga a outros DNMT3s, mas não possui atividade catalítica. Em vez disso, DNMT3L auxilia as metiltransferases de novo , aumentando sua capacidade de se ligar ao DNA e estimulando sua atividade. Camundongos e ratos têm uma terceira enzima metiltransferase funcional de novo chamada DNMT3C, que evoluiu como um parálogo de Dnmt3b por duplicação em tandem no ancestral comum de roedores Muroidea. O DNMT3C catalisa a metilação de promotores de elementos transponíveis durante o início da espermatogênese, atividade que se mostra essencial para sua repressão epigenética e fertilidade masculina. Ainda não está claro se em outros mamíferos que não têm DNMT3C (como os humanos) dependem de DNMT3B ou DNMT3A para metilação de novo de elementos transponíveis na linha germinativa. Finalmente, DNMT2 (TRDMT1) foi identificado como um homólogo de DNA metiltransferase, contendo todos os 10 motivos de sequência comuns a todas as DNA metiltransferases; no entanto, DNMT2 (TRDMT1) não metila o DNA, mas, em vez disso, metila a citosina-38 na alça anticódon do RNA de transferência de ácido aspártico.

Uma vez que muitos genes supressores de tumor são silenciados pela metilação do DNA durante a carcinogênese , tem havido tentativas de reexpressar esses genes inibindo os DNMTs. A 5-Aza-2'-desoxicitidina ( decitabina ) é um análogo de nucleosídeo que inibe os DNMTs ao prendê-los em um complexo covalente no DNA, evitando a etapa de eliminação β da catálise, resultando na degradação das enzimas. No entanto, para que a decitabina seja ativa, ela deve ser incorporada ao genoma da célula, o que pode causar mutações nas células-filhas se a célula não morrer. Além disso, a decitabina é tóxica para a medula óssea, o que limita o tamanho de sua janela terapêutica. Essas armadilhas levaram ao desenvolvimento de terapias de RNA antisense que têm como alvo os DNMTs, degradando seus mRNAs e impedindo sua tradução . No entanto, atualmente não está claro se o direcionamento de DNMT1 sozinho é suficiente para reativar genes supressores de tumor silenciados pela metilação do DNA.

Nas plantas

Progresso significativo foi feito no entendimento da metilação do DNA na planta modelo Arabidopsis thaliana . A metilação do DNA em plantas difere da de mamíferos: enquanto a metilação do DNA em mamíferos ocorre principalmente no nucleotídeo da citosina em um sítio CpG , nas plantas a citosina pode ser metilada nos sítios CpG, CpHpG e CpHpH, onde H representa qualquer nucleotídeo, mas não a guanina . No geral, o DNA de Arabidopsis é altamente metilado, a análise de espectrometria de massa estimou que 14% das citosinas sejam modificadas.

As principais enzimas metiltransferase de DNA de Arabidopsis , que transferem e anexam covalentemente grupos metil ao DNA, são DRM2, MET1 e CMT3. Ambas as proteínas DRM2 e MET1 compartilham homologia significativa com as metiltransferases de mamíferos DNMT3 e DNMT1, respectivamente, enquanto a proteína CMT3 é exclusiva do reino vegetal. Existem atualmente duas classes de DNA metiltransferases: 1) a classe de novo ou enzimas que criam novas marcas de metilação no DNA; 2) uma classe de manutenção que reconhece as marcas de metilação na fita parental do DNA e transfere a nova metilação para as fitas filhas após a replicação do DNA. DRM2 é a única enzima que foi implicada como uma DNA metiltransferase de novo . Também foi demonstrado que o DRM2, junto com o MET1 e o CMT3, está envolvido na manutenção das marcas de metilação por meio da replicação do DNA. Outras metiltransferases de DNA são expressas em plantas, mas não têm função conhecida (veja o banco de dados da cromatina ).

Não está claro como a célula determina os locais de metilação de novo do DNA, mas as evidências sugerem que para muitos (embora não todos) locais, a metilação do DNA dirigida por RNA (RdDM) está envolvida. No RdDM, transcritos específicos de RNA são produzidos a partir de um molde de DNA genômico, e esse RNA forma estruturas secundárias chamadas de moléculas de RNA de fita dupla. Os RNAs de fita dupla, por meio de pequenas vias de RNA interferente ( siRNA ) ou microRNA ( miRNA ), direcionam a metilação de novo do DNA da localização genômica original que produziu o RNA. Acredita-se que esse tipo de mecanismo seja importante na defesa celular contra vírus de RNA e / ou transposons , que frequentemente formam um RNA de fita dupla que pode ser mutagênico para o genoma do hospedeiro. Ao metilar suas localizações genômicas, por meio de um mecanismo ainda pouco conhecido, eles são desligados e não estão mais ativos na célula, protegendo o genoma de seu efeito mutagênico. Recentemente, foi descrito que a metilação do DNA é o principal determinante da formação de culturas embriogênicas a partir de explantes em plantas lenhosas e é considerado o principal mecanismo que explica a fraca resposta de explantes maduros à embriogênese somática nas plantas (Isah 2016).

Em insetos

Ordens diversas de insetos mostram padrões variados de metilação do DNA, de níveis quase indetectáveis ​​em moscas a níveis baixos em borboletas e mais altos em insetos verdadeiros e algumas baratas (até 14% de todos os locais de CG em Blattella asahinai ).

Metilação funcional do DNA foi descoberta em abelhas. As marcas de metilação do DNA estão principalmente no corpo do gene, e as opiniões atuais sobre a função da metilação do DNA é a regulação do gene por meio de splicing alternativo

Os níveis de metilação do DNA em Drosophila melanogaster são quase indetectáveis. Métodos sensíveis aplicados ao DNA de Drosophila sugerem níveis na faixa de 0,1–0,3% da citosina total. Este baixo nível de metilação parece residir em padrões de sequência genômica que são muito diferentes dos padrões vistos em humanos ou em outras espécies animais ou vegetais até hoje. A metilação genômica em D. melanogaster foi encontrada em motivos curtos específicos (concentrados em motivos específicos de sequência de 5 bases que são ricos em CA e CT, mas depletados de guanina) e é independente da atividade DNMT2. Além disso, abordagens de espectrometria de massa altamente sensíveis demonstraram agora a presença de níveis baixos (0,07%), mas significativos, de metilação de adenina durante os primeiros estágios da embriogênese de Drosophila.

Em fungos

Muitos fungos têm níveis baixos (0,1 a 0,5%) de metilação da citosina, enquanto outros fungos têm até 5% do genoma metilado. Este valor parece variar tanto entre espécies quanto entre isolados da mesma espécie. Também há evidências de que a metilação do DNA pode estar envolvida no controle específico do estado da expressão gênica em fungos. No entanto, em um limite de detecção de 250 attomoles usando espectrometria de massa de ultra-alta sensibilidade, a metilação do DNA não foi confirmada em espécies de leveduras celulares únicas, como Saccharomyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe , indicando que as leveduras não possuem esta modificação de DNA.

Embora a levedura de cerveja ( Saccharomyces ), a levedura de fissão ( Schizosaccharomyces ) e o Aspergillus flavus não tenham metilação de DNA detectável, o fungo filamentoso modelo Neurospora crassa tem um sistema de metilação bem caracterizado. Vários genes controlam a metilação em Neurospora e a mutação da DNA metil transferase, dim-2 , elimina toda a metilação do DNA, mas não afeta o crescimento ou a reprodução sexual. Embora o genoma do Neurospora tenha muito pouco DNA repetido, metade da metilação ocorre no DNA repetido, incluindo relíquias do transposon e DNA centromérico. A capacidade de avaliar outros fenômenos importantes em um fundo genético com deficiência de DNA metilase torna o Neurospora um sistema importante para estudar a metilação do DNA.

Em outros eucariotos

A metilação do DNA está amplamente ausente no Dictyostelium discoidium, onde parece ocorrer em cerca de 0,006% das citosinas. Em contraste, a metilação do DNA é amplamente distribuída em Physarum polycephalum, onde a 5-metilcitosina representa até 8% da citosina total

Em bactérias

Todas as metilação em um procarioto . Em alguns organismos procarióticos, todos os três tipos de metilação de DNA previamente conhecidos estão representados (N4-metilcitosina: m4C, 5-metilcitosina: m5C e N6-metiladenina: m6A). Seis exemplos são mostrados aqui, dois dos quais pertencem ao domínio Archaea e quatro dos quais pertencem ao domínio Bacteria. As informações são de Blow et al. (2016). Na coluna da esquerda estão os nomes das espécies dos organismos; à direita, há exemplos de motivos de DNA metilados. Os nomes completos das archaea e cepas bacterianas estão de acordo com a taxonomia do NCBI: "Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661", "Methanocorpusculum labreanum Z", "Clostridium perfringens ATCC 13127", "Geopsychrobacter electrodiphilus DSM 16401", "RhodustropisGA009 C" Rhodustropis009 ". Salmonella enterica subsp. Enterica sorovar Paratyphi A str. ATCC 9150 "

A metilação da adenina ou citosina é mediada por sistemas de modificação de restrição de muitas bactérias , nos quais sequências específicas de DNA são metiladas periodicamente em todo o genoma. A metilase é a enzima que reconhece uma sequência específica e metila uma das bases dessa sequência ou perto dela. Os DNAs estranhos (que não são metilados dessa maneira) que são introduzidos na célula são degradados por enzimas de restrição específicas da sequência e clivados. O DNA genômico bacteriano não é reconhecido por essas enzimas de restrição. A metilação do DNA nativo atua como uma espécie de sistema imunológico primitivo, permitindo que as bactérias se protejam da infecção por bacteriófagos .

E. coli DNA adenina metiltransferase (Dam) é uma enzima de ~ 32 kDa que não pertence a um sistema de restrição / modificação. A sequência de reconhecimento de alvo para E. coli Dam é GATC, uma vez que a metilação ocorre na posição N6 da adenina nesta sequência (G meATC). Os três pares de bases flanqueando cada lado deste local também influenciam a ligação DNA-Dam. Dam desempenha vários papéis importantes nos processos bacterianos, incluindo reparo de incompatibilidade, o tempo de replicação do DNA e expressão gênica. Como resultado da replicação do DNA, o status dos sítios GATC nogenoma de E. coli muda de totalmente metilado para hemimetilado. Isso ocorre porque a adenina introduzida na nova fita de DNA não é metilada. A remetilação ocorre dentro de dois a quatro segundos, tempo durante o qual os erros de replicação na nova fita são reparados. A metilação, ou sua ausência, é o marcador que permite ao aparelho de reparo da célula diferenciar entre o molde e os filamentos nascentes. Foi demonstrado que a alteração da atividade de Dam em bactérias resulta em um aumento da taxa de mutação espontânea. A viabilidade bacteriana é comprometida em mutantes dam que também carecem de certas outras enzimas de reparo de DNA, fornecendo mais evidências para o papel de Dam no reparo de DNA.

Uma região do DNA que mantém seu estado hemimetilado por mais tempo é a origem de replicação , que possui uma abundância de sítios GATC. Isso é fundamental para o mecanismo bacteriano para cronometrar a replicação do DNA. SeqA se liga à origem de replicação, sequestrando-a e evitando a metilação. Como as origens de replicação hemimetiladas são inativas, esse mecanismo limita a replicação do DNA a uma vez por ciclo celular.

A expressão de certos genes, por exemplo, aqueles que codificam a expressão de pilus em E. coli , é regulada pela metilação de locais GATC na região promotora do operon do gene. As condições ambientais das células logo após a replicação do DNA determinam se Dam está impedido de metilar uma região proximal ou distal da região promotora. Uma vez que o padrão de metilação foi criado, a transcrição do gene do pilus é travada na posição ligada ou desligada até que o DNA seja novamente replicado. Em E. coli , esses operons pili têm papéis importantes na virulência em infecções do trato urinário. Foi proposto que os inibidores de Dam podem funcionar como antibióticos.

Por outro lado, a DNA citosina metilase tem como alvo os locais CCAGG e CCTGG para metilar a citosina na posição C5 (C meC (A / T) GG). A outra enzima metilase, EcoKI, causa metilação de adeninas nas sequências AAC (N 6 ) GTGC e GCAC (N 6 ) GTT.

Em Clostridioides difficile , a metilação do DNA no motivo alvo CAAAAA mostrou afetar a esporulação , uma etapa chave na transmissão da doença, bem como o comprimento da célula, formação de biofilme e colonização do hospedeiro.

Clonagem molecular

A maioria das cepas usadas por biólogos moleculares são derivados de E. coli K-12 e possuem Dam e Dcm, mas existem cepas comercialmente disponíveis que são dam- / dcm- (falta de atividade de qualquer uma das metilase). Na verdade, é possível desmetilar o DNA extraído das cepas dam + / dcm +, transformando-o nas cepas dam- / dcm-. Isso ajudaria a digerir sequências que não estão sendo reconhecidas por enzimas de restrição sensíveis à metilação.

A enzima de restrição DpnI pode reconhecer os locais 5'-GmeATC-3 'e digerir o DNA metilado. Por ser um motivo tão curto, ocorre frequentemente em sequências ao acaso e, como tal, seu principal uso para os pesquisadores é degradar o DNA do molde após PCRs (produtos de PCR não têm metilação, já que nenhuma metilase está presente na reação). Da mesma forma, algumas enzimas de restrição disponíveis comercialmente são sensíveis à metilação em seus sítios de restrição cognatos e devem, como mencionado anteriormente, ser usadas no DNA passado por uma cepa dam- / dcm- para permitir o corte.

Detecção

A metilação do DNA pode ser detectada pelos seguintes ensaios atualmente usados ​​em pesquisas científicas:

  • A espectrometria de massa é um método analítico muito sensível e confiável para detectar a metilação do DNA. O MS, em geral, não é, entretanto, informativo sobre o contexto da sequência da metilação, portanto, limitado no estudo da função dessa modificação do DNA.
  • PCR específico para metilação (MSP) , que é baseado em uma reação química de bissulfito de sódio com DNA que converte citosinas não metiladas de dinucleotídeos CpG em uracila ou UpG, seguido por PCR tradicional . No entanto, as citosinas metiladas não serão convertidas neste processo, e os primers são projetados para se sobrepor ao local CpG de interesse, o que permite determinar o estado de metilação como metilado ou não metilado.
  • Sequenciamento de bissulfito do genoma inteiro , também conhecido como BS-Seq, que é uma análise de metilação do DNA de alto rendimento em todo o genoma. Baseia-se na já mencionada conversão de bissulfito de sódio de DNA genômico, que é então sequenciado em uma plataforma de sequenciamento de última geração . As sequências obtidas são então realinhadas com o genoma de referência para determinar o estado de metilação dos dinucleotídeos CpG com base em incompatibilidades resultantes da conversão de citosinas não metiladas em uracila.
  • O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida , também conhecido como RRBS, conhece vários protocolos de trabalho. O primeiro protocolo RRBS foi denominado RRBS e visa cerca de 10% do metiloma, sendo necessário um genoma de referência. Posteriormente, surgiram mais protocolos capazes de sequenciar uma porção menor do genoma e aumentar a multiplexação de amostras. EpiGBS foi o primeiro protocolo em que você poderia multiplexar 96 amostras em uma linha de sequenciamento Illumina e onde um genoma de referência não fosse mais necessário. Uma construção de referência de novo das leituras de Watson e Crick tornou a triagem populacional de SNPs e SMPs simultaneamente um fato.
  • O ensaio HELP , que se baseia na capacidade diferencial das enzimas de restrição de reconhecer e clivar os sítios de DNA CpG metilados e não metilados.
  • Ensaio GLAD-PCR , que é baseado em um novo tipo de enzimas - endonucleases de DNA dirigidas por metila específicas do local, que hidrolisam apenas DNA metilado.
  • Ensaios ChIP-on-chip , que se baseiam na capacidade de anticorpos preparados comercialmente para se ligarem a proteínas associadas à metilação de DNA, como MeCP2.
  • Varredura genômica de referência de restrição , um ensaio complicado e agora raramente usado com base no reconhecimento diferencial de enzimas de restrição de sítios CpG metilados e não metilados; o ensaio é semelhante em conceito ao ensaio HELP.
  • Imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP), análoga à imunoprecipitação da cromatina , a imunoprecipitação é usada para isolar fragmentos de DNA metilados para entrada em métodos de detecção de DNA, como microarranjos de DNA (MeDIP-chip) ou sequenciamento de DNA (MeDIP-seq).
  • Pirosequenciamento de DNA tratado com bissulfito. Este é o sequenciamento de um amplicon feito por um primer direto normal, mas um primer reverso biotinilado para PCR do gene de escolha. O Pyrosequencer então analisa a amostra desnaturando o DNA e adicionando um nucleotídeo por vez à mistura de acordo com uma sequência fornecida pelo usuário. Se houver uma incompatibilidade, ela é registrada e a porcentagem de DNA para a qual a incompatibilidade está presente é anotada. Isso dá ao usuário uma porcentagem de metilação por ilha CpG.
  • Ensaio de quebra de luz molecular para atividade de DNA adenina metiltransferase - um ensaio que se baseia na especificidade da enzima de restrição DpnI para sítios GATC totalmente metilados (metilação de adenina) em um oligonucleotídeo marcado com um fluoróforo e inibidor. A adenina metiltransferase metila o oligonucleotídeo tornando-o um substrato para DpnI. O corte do oligonucleotídeo por DpnI dá origem a um aumento de fluorescência.
  • Southern blotting sensível a metila é semelhante ao ensaio HELP, embora use técnicas de Southern blotting para sondar diferenças específicas do gene na metilação usando digestão de restrição. Esta técnica é usada para avaliar a metilação local perto do sítio de ligação para a sonda.
  • Proteínas de ligação MethylCpG (MBPs) e proteínas de fusão contendo apenas o domínio de ligação de metila (MBD) são usadas para separar o DNA nativo em frações metiladas e não metiladas. A porcentagem de metilação de ilhas CpG individuais pode ser determinada quantificando a quantidade do alvo em cada fração. A detecção extremamente sensível pode ser alcançada em tecidos FFPE com detecção baseada em abscrição.
  • A análise de fusão de alta resolução (HRM ou HRMA) é uma técnica analítica pós- PCR . O DNA alvo é tratado com bissulfito de sódio, que converte quimicamente citosinas não metiladas em uracilos, enquanto as citosinas metiladas são preservadas. A amplificação por PCR é então realizada com primers projetados para amplificar modelos metilados e não metilados. Após esta amplificação, as sequências de DNA altamente metiladas contêm um número maior de locais CpG em comparação com os modelos não metilados, o que resulta em uma temperatura de fusão diferente que pode ser usada na detecção de metilação quantitativa.
  • Reconstrução de metilação de DNA antigo, um método para reconstruir metilação de DNA de alta resolução a partir de amostras de DNA antigo. O método é baseado nos processos naturais de degradação que ocorrem no DNA antigo: com o tempo, as citosinas metiladas são degradadas em tinas, enquanto as citosinas não metiladas são degradadas em uracilos. Essa assimetria nos sinais de degradação foi usada para reconstruir os mapas completos de metilação do Neandertal e do Denisovan . Em setembro de 2019, os pesquisadores publicaram um novo método para inferir características morfológicas a partir de dados de metilação do DNA. Os autores foram capazes de mostrar que ligar genes regulados para baixo a fenótipos de doenças monogênicas, onde uma ou duas cópias de um gene são perturbadas, permite uma precisão de ~ 85% na reconstrução de características anatômicas diretamente de mapas de metilação de DNA.
  • Ensaio de extensão de iniciador de nucleotídeo único sensível à metilação (msSNuPE), que usa iniciadores internos que emparelham em linha reta 5 'do nucleotídeo a ser detectado.
  • O Ensaio de Metilação da Illumina mede a metilação do DNA específico do locus usando a hibridização de array. O DNA tratado com bissulfito é hibridizado com sondas em "BeadChips". A extensão de base única com sondas marcadas é usada para determinar o estado de metilação dos locais alvo. Em 2016, foi lançado o Infinium MethylationEPIC BeadChip, que interroga mais de 850.000 locais de metilação em todo o genoma humano.
  • Usando o sequenciamento de nanopore, os pesquisadores identificaram diretamente modificações de bases de DNA e RNA na resolução de nucleotídeos, incluindo 5mC, 5hmC, 6mA e BrdU no DNA e m6A no RNA, com detecção de outras modificações epigenéticas naturais ou sintéticas possíveis por meio de algoritmos de chamada de base de treinamento.

Regiões diferencialmente metiladas (DMRs)

As regiões diferencialmente metiladas , são regiões genômicas com diferentes estados de metilação entre várias amostras (tecidos, células, indivíduos ou outros), são consideradas como possíveis regiões funcionais envolvidas na regulação da transcrição gênica. A identificação de DMRs entre vários tecidos (T-DMRs) fornece uma pesquisa abrangente das diferenças epigenéticas entre os tecidos humanos. Por exemplo, essas regiões metiladas que são exclusivas de um determinado tecido permitem que os indivíduos diferenciem entre os tipos de tecido, como sêmen e fluido vaginal. A pesquisa atual conduzida por Lee et al., Mostrou que DACT1 e USP49 identificaram positivamente o sêmen examinando T-DMRs. O uso de T-DMRs tem se mostrado útil na identificação de vários fluidos corporais encontrados em cenas de crime. Pesquisadores da área forense estão atualmente em busca de novos T-DMRs em genes para usar como marcadores em análises forenses de DNA. DMRs entre câncer e amostras normais (C-DMRs) demonstram a metilação aberrante em cânceres. É bem conhecido que a metilação do DNA está associada à diferenciação e proliferação celular. Muitos DMRs foram encontrados nos estágios de desenvolvimento (D-DMRs) e no progresso reprogramado (R-DMRs). Além disso, existem DMRs intra-individuais (Intra-DMRs) com alterações longitudinais na metilação global do DNA junto com o aumento da idade em um determinado indivíduo. Existem também DMRs interindividuais (Inter-DMRs) com diferentes padrões de metilação entre vários indivíduos.

QDMR (Quantitative Differentially Methylated Regions) é uma abordagem quantitativa para quantificar a diferença de metilação e identificar DMRs de perfis de metilação de todo o genoma, adaptando a entropia de Shannon. A natureza livre de plataforma e de espécie de QDMR torna-o potencialmente aplicável a vários dados de metilação. Esta abordagem fornece uma ferramenta eficaz para a identificação de alto rendimento das regiões funcionais envolvidas na regulação epigenética. QDMR pode ser usado como uma ferramenta eficaz para a quantificação da diferença de metilação e identificação de DMRs em várias amostras.

A análise do conjunto de genes (também conhecida como análise de caminho; ferramentas normalmente realizadas, como DAVID, GoSeq ou GSEA) mostrou ser severamente enviesada quando aplicada a dados de metilação de alto rendimento (por exemplo, MeDIP-seq, MeDIP-ChIP, HELP-seq etc. ), e uma ampla gama de estudos relatou, portanto, erroneamente hipermetilação de genes relacionados ao desenvolvimento e à diferenciação; foi sugerido que isso pode ser corrigido usando permutações de marcadores de amostra ou usando um modelo estatístico para controlar as diferenças no número de sondas CpG / locais CpG que têm como alvo cada gene.

Marcas de metilação de DNA

As marcas de metilação do DNA - regiões genômicas com padrões específicos de metilação em um estado biológico específico, como tecido, tipo de célula, indivíduo - são consideradas possíveis regiões funcionais envolvidas na regulação da transcrição do gene. Embora vários tipos de células humanas possam ter o mesmo genoma, essas células têm metilomas diferentes. A identificação sistemática e caracterização de marcas de metilação em todos os tipos de células são cruciais para a compreensão da complexa rede reguladora para a determinação do destino celular. Hongbo Liu et al. propôs uma estrutura baseada em entropia denominada SMART para integrar metilomas de sequenciamento de bissulfito do genoma em 42 tecidos / células humanos e identificou 757.887 segmentos do genoma. Quase 75% dos segmentos mostraram metilação uniforme em todos os tipos de células. Dos 25% restantes dos segmentos, eles identificaram marcas de hipo / hipermetilação específicas do tipo de célula que foram especificamente hipo / hipermetiladas em uma minoria de tipos de células usando uma abordagem estatística e apresentaram um atlas das marcas de metilação humana. Uma análise posterior revelou que as marcas de hipometilação específicas do tipo de célula foram enriquecidas através de H3K27ac e locais de ligação do fator de transcrição de uma maneira específica do tipo de célula. Em particular, eles observaram que as marcas de hipometilação específicas do tipo de célula estão associadas aos super intensificadores específicos do tipo de célula que conduzem a expressão de genes de identidade celular. Esta estrutura fornece uma anotação complementar e funcional do genoma humano e ajuda a elucidar as características e funções críticas da hipometilação específica do tipo de célula.

A ferramenta de análise e relatório de metilação específica baseada em entropia, denominada "SMART", que se concentra na integração de um grande número de metilomas de DNA para a identificação de novo de marcas de metilação específicas do tipo de célula. A última versão do SMART é focada em três funções principais, incluindo identificação de novo de regiões diferencialmente metiladas (DMRs) por segmentação do genoma, identificação de DMRs de regiões predefinidas de interesse e identificação de locais CpG diferencialmente metilados.

Na identificação e detecção de fluidos corporais

A metilação do DNA permite que vários tecidos sejam analisados ​​em um ensaio, bem como que pequenas quantidades de fluido corporal sejam identificadas com o uso do DNA extraído. Normalmente, as duas abordagens de metilação do DNA são enzimas de restrição sensíveis à metilado ou tratamento com bissulfito de sódio. As enzimas de restrição sensíveis metiladas funcionam clivando CpG, citosina e guanina específicos separados por apenas um grupo fosfato, locais de reconhecimento quando o CpG é metilado. Em contraste, as citosinas não metiladas são transformadas em uracila e, no processo, as citosinas metiladas permanecem metiladas. Em particular, os perfis de metilação podem fornecer informações sobre quando ou como os fluidos corporais foram deixados nas cenas do crime, identificar o tipo de fluido corporal e idade aproximada, sexo e características fenotípicas dos perpetradores. A pesquisa indica vários marcadores que podem ser usados ​​para a metilação do DNA. Decidir qual marcador usar para um ensaio é uma das primeiras etapas da identificação de fluidos corporais. Em geral, os marcadores são selecionados examinando pesquisas anteriores realizadas. Os marcadores de identificação escolhidos devem dar um resultado positivo para um tipo de célula. Uma parte do cromossomo que é uma área de foco durante a metilação do DNA são regiões diferencialmente metiladas específicas de tecido, T-DMRs. O grau de metilação para os T-DMRs varia dependendo do fluido corporal. Uma equipe de pesquisa desenvolveu um sistema de marcadores duplo. O primeiro marcador é metilado apenas no fluido alvo, enquanto o segundo é metilado no resto dos fluidos. Por exemplo, se o marcador de sangue venoso A não for metilado e o marcador de sangue venoso B estiver metilado em um fluido, isso indica a presença apenas de sangue venoso. Em contraste, se o marcador de sangue venoso A for metilado e o marcador de sangue venoso B não metilado em algum fluido, isso indica que o sangue venoso está em uma mistura de fluidos. Alguns exemplos de marcadores de metilação do DNA são Mens1 (sangue menstrual), Spei1 (saliva) e Sperm2 (fluido seminal).

A metilação do DNA fornece um meio relativamente bom de sensibilidade ao identificar e detectar fluidos corporais. Em um estudo, apenas dez nanogramas de uma amostra foram necessários para verificar os resultados bem-sucedidos. A metilação do DNA fornece um bom discernimento de amostras misturadas, uma vez que envolve marcadores que fornecem sinais “ligados ou desligados”. A metilação do DNA não é imune a condições externas. Mesmo sob condições degradadas usando as técnicas de metilação do DNA, os marcadores são estáveis ​​o suficiente para que ainda existam diferenças perceptíveis entre as amostras degradadas e as amostras de controle. Especificamente, em um estudo, verificou-se que não havia nenhuma mudança perceptível nos padrões de metilação ao longo de um longo período de tempo.

Predição computacional

A metilação do DNA também pode ser detectada por modelos computacionais por meio de algoritmos e métodos sofisticados. Os modelos computacionais podem facilitar o perfil global da metilação do DNA nos cromossomos e, muitas vezes, esses modelos são mais rápidos e baratos de realizar do que os ensaios biológicos. Esses modelos computacionais atualizados incluem Bhasin, et al. , Bock, et al ., E Zheng, et al . Junto com o ensaio biológico, esses métodos facilitam muito a análise de metilação do DNA.

Veja também

Referências

Leitura adicional

links externos