Microfluídica baseada em gotículas - Droplet-based microfluidics
Os microfluídicos baseados em gotículas manipulam volumes discretos de fluidos em fases imiscíveis com baixo número de Reynolds e regimes de fluxo laminar . O interesse em sistemas microfluídicos baseados em gotículas tem crescido substancialmente nas últimas décadas. Microgotículas oferecem a viabilidade de manusear volumes em miniatura (μl a fl) de fluidos de forma conveniente, fornecem melhor mistura, encapsulamento, classificação, detecção e são adequadas para experimentos de alto rendimento. Duas fases imiscíveis usadas para os sistemas baseados em gotículas são referidas como a fase contínua (meio em que as gotículas fluem) e a fase dispersa (a fase de gotículas).
Métodos de formação de gotículas
Para que ocorra a formação de gotas, devem ser utilizadas duas fases imiscíveis, denominadas fase contínua (meio em que as gotas são geradas) e fase dispersa (fase gota). O tamanho das gotículas geradas é controlado principalmente pela taxa de vazão da fase contínua e da fase dispersa, tensão interfacial entre duas fases e a geometria dos canais usados para a geração de gotículas. As gotas podem ser formadas passiva e ativamente. A formação de gotículas ativas (elétrica, magnética, centrífuga) costuma usar dispositivos semelhantes à formação passiva, mas requer uma entrada de energia externa para a manipulação das gotículas. A formação de gotículas passivas tende a ser mais comum do que ativa, pois produz resultados semelhantes com designs de dispositivos mais simples. Geralmente, três tipos de geometrias microfluídicas são utilizados para geração de gotículas passivas: (i) Fluxo Cruzado, (ii) Focalização de Fluxo e (iii) Co-Fluxo. Os microfluídicos baseados em gotículas geralmente operam com números baixos de Reynold para garantir o fluxo laminar dentro do sistema. O tamanho da gota é frequentemente quantificado com coeficiente de variação (CV) como uma descrição do desvio padrão do tamanho médio da gota. Cada um dos métodos listados fornece uma maneira de gerar gotículas microfluídicas de uma maneira controlável e ajustável com manipulação variável adequada.
Formação de gotículas de fluxo cruzado
O escoamento cruzado é um método de formação passiva que envolve as fases contínua e aquosa em ângulo uma com a outra. Mais comumente, os canais são perpendiculares em uma junção em forma de T com a fase dispersa interceptando a fase contínua; outras configurações, como uma junção em Y, também são possíveis. A fase dispersa se estende para o contínuo e é esticada até que as forças de cisalhamento quebrem uma gota. Em uma junção em T, o tamanho da gota e a taxa de formação são determinados pela razão da taxa de fluxo e número capilar . O número capilar relaciona a viscosidade da fase contínua, a velocidade superficial da fase contínua e a tensão interfacial. Normalmente, a taxa de fluxo da fase dispersa é mais lenta do que a taxa de fluxo contínuo. A formação da junção em T pode ser aplicada adicionando canais adicionais, criando duas junções em T em um local. Ao adicionar canais, diferentes fases dispersas podem ser adicionadas no mesmo ponto para criar gotículas alternadas de diferentes composições. O tamanho da gota, geralmente acima de 10 μm, é limitado pelas dimensões do canal e frequentemente produz gotas com um CV de menos de 2% com uma taxa de até 7 kHz [4] .
Formação de gotículas de foco de fluxo
A focagem de fluxo é um método de formação geralmente passivo que envolve a fase dispersa fluindo para encontrar a fase contínua normalmente em um ângulo (fluxos não paralelos), então passando por uma restrição que cria uma gota. Esta restrição é geralmente um estreitamento no canal para criar a gota através de cisalhamento simétrico, seguido por um canal de largura igual ou maior. Tal como acontece com o fluxo cruzado, a taxa de fluxo da fase contínua é tipicamente maior do que a taxa de fluxo da fase dispersa. Diminuir o fluxo da fase contínua pode aumentar o tamanho das gotas. A focagem de fluxo também pode ser um método ativo com o ponto de restrição sendo ajustável usando câmaras laterais pneumáticas controladas por ar comprimido. As câmaras móveis atuam para prender o fluxo, deformando o fluxo e criando uma gota com uma frequência de condução variável. O tamanho da gota é geralmente em torno de várias centenas de nanômetros com um CV de menos de 3% e uma taxa de até várias centenas de Hz a dezenas de kHz.
Formação de gotículas co-fluindo
O co-flow é um método passivo de formação de gotículas em que o canal de fase dispersa é encerrado dentro de um canal de fase contínua. No final do canal da fase dispersa, o fluido é esticado até que se rompa com as forças de cisalhamento e forme gotículas por gotejamento ou jato. O gotejamento ocorre quando as forças capilares dominam o sistema e as gotas são criadas no ponto final do canal. O jateamento ocorre, por alargamento ou alongamento, quando a fase contínua se move mais lentamente, criando um fluxo a partir da abertura do canal da fase dispersa. Sob o regime de alargamento, a fase dispersa está se movendo mais rápido do que a fase contínua causando uma desaceleração da fase dispersa, alargando a gota e aumentando o diâmetro. Sob o regime de alongamento, o arrasto viscoso domina, fazendo com que o fluxo se estreite, criando uma gota menor. O efeito da taxa de fluxo de fase contínua no tamanho da gota depende se o sistema está em um regime de alongamento ou alargamento, portanto, diferentes equações devem ser usadas para prever o tamanho da gota. O tamanho da gota é geralmente em torno de várias centenas de nanômetros com um CV de menos de 5% e uma taxa de até dezenas de kHz.
Manipulação de gotículas
Os benefícios da microfluídica podem ser aumentados para um rendimento mais alto usando canais maiores para permitir a passagem de mais gotas ou aumentando o tamanho das gotas. O tamanho da gota pode ser ajustado ajustando a taxa de fluxo das fases contínua e dispersa, mas o tamanho da gota é limitado pela necessidade de manter a concentração, as distâncias entre analitos e a estabilidade das microgotículas. Assim, o tamanho aumentado do canal torna-se atraente devido à capacidade de criar e transportar um grande número de gotículas, embora a dispersão e a estabilidade das gotículas se tornem uma preocupação. Finalmente, a mistura completa das gotículas para expor o maior número possível de reagentes é necessária para garantir que a quantidade máxima de materiais de partida reaja. Isso pode ser feito usando um canal de vento para facilitar o fluxo laminar instável dentro das gotículas.
Surfactantes em microfluídicos baseados em gotículas
Os surfactantes desempenham um papel importante na microfluídica baseada em gotículas. O principal objetivo do uso de um surfactante é reduzir a tensão interfacial entre a fase dispersa (fase de gotícula, normalmente aquosa) e a fase contínua (líquido transportador, normalmente óleo) por adsorção em interfaces e evitando que as gotículas coalescam umas com as outras, estabilizando assim o gotas em um estado de emulsão estável , o que permite tempos de armazenamento mais longos em linhas de retardo, reservatórios ou frascos. Sem o uso de surfactantes, as emulsões instáveis irão eventualmente evoluir para fases separadas para reduzir a energia geral do sistema. A química da superfície não pode ser ignorada na microfluídica, pois a tensão interfacial se torna uma consideração importante entre as gotículas em microescala. Linas Mazutis e Andrew D. Griffiths apresentaram um método que utiliza surfactantes para obter uma coalescência seletiva e altamente controlável sem manipulação externa. Eles manipulam o tempo de contato e a cobertura do surfactante interfacial de um par de gotas para controlar a fusão das gotas. Quanto maior a diferença percentual da cobertura do surfactante interfacial entre duas gotas, menos provável ocorrerá coalescência. Este método permitiu aos pesquisadores adicionar reagentes às gotículas de uma maneira diferente e estudar mais a emulsificação.
A microfluídica é amplamente utilizada para experimentos bioquímicos, por isso é importante que os surfactantes sejam biocompatíveis ao trabalhar com células vivas e análises de alto rendimento. Os surfactantes usados em dispositivos de pesquisa com células vivas não devem interferir nas reações bioquímicas ou nas funções celulares. O óleo de hidrocarboneto normalmente não é usado na pesquisa de microfluidos celulares porque não é compatível com as células e danifica a viabilidade celular. O óleo de hidrocarboneto também extrai moléculas orgânicas da fase aquosa. No entanto, os fluorosurfactantes com caudas fluoradas, por exemplo, são usados como um emulsificante de gotículas compatível que estabiliza as gotículas contendo células em seu interior, sem danificar ou alterar as células. Os fluorosurfactantes são solúveis em um óleo fluorado (fase contínua), mas insolúveis na fase aquosa, o que resulta na diminuição da tensão interfacial aquosa-fluorosa. Por exemplo, um surfactante de copolímero tribloco contendo duas caudas de perfluoropoliéter (PFPE) e um grupo de cabeça de bloco de polietilenoglicol (PEG) é um fluorosurfactante com grande biocompatibilidade e excelente estabilidade de gotículas contra coalescência. Outro exemplo são os poligliceróis lineares fluorados, que podem ser funcionalizados posteriormente em suas cadeias laterais personalizadas e são mais personalizáveis em comparação com o copolímero à base de PEG. Os surfactantes podem ser adquiridos de muitas empresas químicas, como RainDance Technologies (agora através da BioRad) e Miller-Stephenson.
Considerações Físicas
Após a adição de surfactantes ou sais inorgânicos a um sistema microfluídico à base de gotículas, a tensão interfacial de gotículas individuais se altera dentro do sistema microfluídico. Esses componentes separatórios permitem a utilização das gotículas como microrreatores para diversos mecanismos de procedimento. A fim de descrever a relação entre a tensão interfacial (), a concentração de surfactantes / sais dissociados na gota em massa (C) , Temperatura ( T) , constante de Boltzmann ( k B ) e a concentração de surfactantes / sais dissociados na interface ( Γ), foi criada a isoterma de adsorção de Gibbs , uma seção simplificada destacando informações relevantes exibidas à direita.
Esta isoterma reafirma a noção de que enquanto a concentração de sal inorgânico aumenta, os sais são esgotados da interface da gota (Γ <0) e a tensão da interface da gota aumenta. Isso é contrastado por surfactantes, que adsorvem na interface (Γ> 0), e menor tensão interfacial. Em baixas concentrações de surfactante, a tensão superficial diminui de acordo com a isoterma de adsorção de Gibbs, até que uma determinada concentração seja atingida, conhecida como concentração micelar crítica (CMC), quando as micelas começam a se formar. Ao atingir o CMC, a concentração do surfactante dissolvido atinge um máximo, onde os monômeros do surfactante se agregam para formar micelas de tamanho nanométrico. Devido a esse potencial de formação de micelas, três etapas podem ser utilizadas na análise da adsorção dos surfactantes à interface da gota. Primeiro, as moléculas de surfactante são adsorvidas entre a camada superficial e a camada subsuperficial. Em segundo lugar, as moléculas são trocadas entre a subsuperfície e a solução em massa. Terceiro, as micelas relaxam, causado pela quebra do equilíbrio entre as moléculas livres e as micelas.
As moléculas que constituem cada micela são organizadas de acordo com a solução em que estão suspensas, com as porções mais solúveis em contato com a solução e as menos solúveis da molécula em contato umas com as outras. Dependendo da proporção do volume das cabeças polares e cauda apolar, vários surfactantes foram encontrados para formar agregados maiores, estruturas ocas de duas camadas conhecidas como vesículas . Um surfactante notável que foi testemunhado a formar vesículas é o AOT (sal de sódio de dioctil sulfosuccinato). Essas micelas e vesículas são descobertas relativamente novas; no entanto, eles têm sido utilizados para transportar agentes dentro de sistemas microfluídicos, revelando futuras aplicações para transportes microfluídicos.
Adição de reagente
As reações em microescala realizadas em aplicações baseadas em gotículas conservam os reagentes e reduzem o tempo de reação, tudo em taxas de quilohertz. A adição de reagentes a microrreatores de gotículas tem sido um foco de pesquisa devido à dificuldade de alcançar adições reproduzíveis em taxas de quilohertz sem contaminação gota a gota.
Cofluxo de reagente antes da formação de gotículas
Os reagentes podem ser adicionados no momento da formação das gotas por meio de uma geometria de “co-fluxo”. Os fluxos de reagentes são bombeados em canais separados e se unem na interface a um canal que contém a fase contínua, que corta e cria gotículas contendo ambos os reagentes. Alterando as taxas de fluxo nos canais de reagentes, as proporções de reagentes dentro de uma gota podem ser controladas.
Fusão de gotículas
A fusão de gotículas com diferentes conteúdos também pode ser explorada para adição de reagentes. A eletro-coalescência mescla pares de gotículas aplicando um campo elétrico para desestabilizar temporariamente a interface gota-gota para alcançar a fusão de gotículas reproduzível em emulsões estabilizadas com surfactante. A eletro-coalescência requer que as gotículas (que normalmente são separadas pela fase contínua) entrem em contato. Ao manipular o tamanho das gotículas em fluxos separados, o fluxo diferencial de tamanhos de gotículas pode fazer com que as gotículas entrem em contato antes de se fundirem.
Outro método para facilitar a fusão de gotículas é a pinça acústica. Enquanto as gotas estão fluindo em canais microfluídicos, elas podem ser imobilizadas usando uma pinça acústica baseada em ondas acústicas de superfície . Uma vez que uma gota é presa com a pinça acústica, gotas consecutivas colidem nela e a fusão ocorre.
Injeção de reagentes em gotículas existentes
Os métodos de co-fluxo de reagente e fusão de gotículas estão ligados a eventos de formação de gotículas que carecem de flexibilidade a jusante. Para desacoplar a adição de reagente da criação de gotículas, é utilizada uma configuração em que o fluxo de reagente flui através de um canal perpendicular ao fluxo de gotículas. Uma gota de injeção é então fundida com o tampão à medida que passa pelo canal. O volume do reagente é controlado pela taxa de fluxo do canal perpendicular do reagente.
Um desafio inicial para tais sistemas é que a fusão das gotículas de reagente não era reproduzível para emulsões estáveis. Adaptando o uso de um campo elétrico atuado nesta geometria, Abate et al. alcançou o controle sub-picolitro da injeção do reagente. Essa abordagem, chamada de picoinjeção, controla o volume de injeção por meio da pressão do fluxo de reagente e da velocidade da gota. Trabalhos adicionais sobre este método objetivam reduzir as flutuações de pressão que impedem injeções reproduzíveis.
A injeção do fluido aquoso pressurizado ocorre quando os eletrodos são ativados criando um campo elétrico que desestabiliza a interface fluido / óleo aquoso, desencadeando a injeção. As principais vantagens da picoinjeção incluem baixa transferência inadvertida de material entre as gotículas e manutenção da compartimentalização das gotículas através da injeção, no entanto, os eletrodos são frequentemente fabricados usando solda de metal que pode complicar a construção do dispositivo microfluídico através do aumento do tempo de fabricação como resultado de um design mais intrincado . Um método alternativo de picoinjeção envolve a utilização do reagente de injeção como o condutor de um campo elétrico onde uma voltagem aplicada ao fluido estimula a injeção. Tal método também permite maior controle da injeção, pois a voltagem aplicada corresponde ao volume de fluido reagente injetado.
A contaminação gota a gota é um desafio para muitos métodos de injeção. Para combater isso, Doonan et al. desenvolveu um canal K multifuncional, que flui fluxos de reagentes opostos ao caminho do fluxo de gotículas. Utilizando uma interface entre os dois canais, a injeção é obtida de forma semelhante à picoinjeção, mas qualquer contaminação bilateral é eliminada através do fluxo contínuo de reagente. A contaminação é evitada à custa do desperdício potencial de reagentes preciosos.
Incubação de gotículas
A fim de tornar a microfluídica à base de gotículas uma técnica viável para realizar reações químicas ou trabalhar com células vivas em microescala, é necessário implementar métodos que permitam a incubação de gotículas. As reações químicas geralmente precisam de tempo para ocorrer, e as células vivas também precisam de tempo para crescer, se multiplicar e realizar processos metabólicos . A incubação das gotas pode ser realizada dentro do próprio dispositivo (no chip) ou externamente (fora do chip), dependendo dos parâmetros do sistema. A incubação fora do chip é útil para períodos de incubação de um dia ou mais ou para a incubação de milhões de gotículas por vez. A incubação no chip permite a integração das etapas de manipulação e detecção de gotículas em um único dispositivo.
Incubação fora do chip
Gotículas contendo células podem ser armazenadas fora do chip em tubos de PTFE por até vários dias, mantendo a viabilidade celular e permitindo a reinjeção em outro dispositivo para análise. A evaporação de fluidos aquosos e à base de óleo foi relatada com armazenamento de gotículas em tubos de PTFE, portanto, para armazenamento por mais de vários dias, capilares de vidro também são usados. Finalmente, após a formação em um dispositivo microfluídico, as gotículas também podem ser guiadas através de um sistema de capilares e tubos que levam a uma seringa. As gotas podem ser incubadas na seringa e, em seguida, injetadas diretamente em outro chip para posterior manipulação ou detecção e análise.
Incubação no chip
Linhas de atraso são usadas para incubar gotículas no chip. Após a formação, as gotículas podem ser introduzidas em um canal em serpentina com comprimento de até um metro ou mais. Aumentar a profundidade e a largura do canal da linha de retardo (em comparação com os canais usados para formar e transportar gotículas) permite tempos de incubação mais longos, minimizando a contrapressão do canal . Por causa do tamanho do canal maior, as gotículas enchem o canal da linha de retardo e incubam no tempo que leva para atravessar este canal.
As linhas de retardo foram originalmente projetadas para incubar gotículas contendo misturas de reação química e eram capazes de atingir tempos de retardo de até uma hora. Esses dispositivos fazem uso de canais de linha de retardo com dezenas de centímetros de comprimento. Aumentar o comprimento total dos canais da linha de retardo para um ou mais metros tornou possíveis os tempos de incubação de 12 ou mais horas. As linhas de atraso demonstraram manter a estabilidade das gotículas por até 3 dias, e a viabilidade celular foi demonstrada usando linhas de atraso no chip por até 12 horas. Antes do desenvolvimento das linhas de retardo, a incubação no chip era realizada direcionando gotas para grandes reservatórios (vários milímetros de comprimento e largura), o que oferece alta capacidade de armazenamento e menor complexidade de construção e operação do dispositivo se o controle de tempo preciso das gotas for não requerido.
Se for importante ter uma distribuição uniforme dos tempos de incubação para as gotículas, o canal da linha de retardo pode conter constrições espaçadas regularmente. As gotículas que fluem através de um canal de diâmetro uniforme viajam em velocidades diferentes com base em sua posição radial; as gotas mais próximas do centro do canal movem-se mais rápido do que as próximas às bordas. Ao estreitar a largura do canal para uma fração de seu tamanho original, as gotículas com velocidades mais altas são forçadas a se equilibrar com as gotículas de movimento mais lento porque a constrição permite que menos gotículas passem de cada vez. Outra manipulação da geometria do canal da linha de retardo envolve a introdução de curvas na trajetória das gotas. Isso aumenta a extensão em que quaisquer reagentes contidos nas gotículas são misturados por meio de advecção caótica . Para sistemas que requerem a incubação de 100 a 1000 gotas, as armadilhas podem ser fabricadas no canal da linha de retardo que armazenam as gotas separadamente umas das outras. Isso fornece controle e monitoramento mais precisos de gotas individuais.
Gotículas magnéticas
O método micromagnofluídico é o controle de fluidos magnéticos por um campo magnético aplicado em uma plataforma microfluídica, oferecendo controle sem fio e programável das gotículas magnéticas. Assim, a força magnética também pode ser utilizada para realizar várias operações lógicas, além da força hidrodinâmica e da força de tensão superficial. A intensidade do campo magnético, tipo de campo magnético (gradiente, uniforme ou rotativo), susceptibilidade magnética, tensão interfacial , taxas de fluxo e taxas de fluxo determinam o controle das gotas em uma plataforma micromagnofluídica.
As gotículas magnéticas, no contexto da microfluídica à base de gotículas, são gotículas de tamanho de microlitro que são compostas de ferrofluidos ou contêm algum componente magnético que permite a manipulação por meio de um campo magnético aplicado. Ferrofluidos são misturas homogêneas de soluções coloidais de nanopartículas magnéticas em um transportador líquido. Duas aplicações de gotículas magnéticas são o controle e manipulação de gotículas microfluídicas em um microambiente e a fabricação, transporte e utilização de construções de nanomateriais nas microgotículas. A manipulação de gotículas magnéticas pode ser usada para realizar tarefas como organizar as gotículas em uma matriz ordenada para aplicações em estudos de cultura de células, enquanto o uso de gotículas magnéticas para a fabricação de nanoestruturas pode ser usado em aplicações de distribuição de drogas.
Gotículas magnéticas em sistemas não tradicionais
Nos sistemas microfluídicos tradicionais à base de gotículas, ou seja, uma gotícula em um canal que contém um óleo imiscível que separa as gotículas, o movimento das gotículas é obtido por meio de diferenças de pressão ou tensão superficial. Em sistemas microfluídicos não tradicionais baseados em gotículas, como aqueles aqui descritos, outros mecanismos de controle são necessários para manipular as gotículas. A aplicação de um campo magnético a uma matriz de microfluidos contendo gotículas magnéticas permite uma classificação e disposição facilmente alcançadas das gotículas em padrões e configurações úteis. Esses tipos de manipulação podem ser obtidos por meio da aplicação estática ou dinâmica de um campo magnético que permite um alto grau de controle sobre as gotículas magnéticas. A caracterização do grau de controle sobre gotículas magnéticas inclui medições da suscetibilidade magnética do ferrofluido, medição da mudança na gota na área de interface do substrato na presença de um campo magnético aplicado e medição do "ângulo de roll-off" ou ângulo no qual a gota se moveria na presença de um campo magnético quando a superfície fosse inclinada. As interações entre a gota de água e a superfície podem ser manipuladas ajustando a estrutura do próprio sistema microfluídico aplicando um campo magnético ao poli [dimetilsiloxano] dopado com ferro (PDMS), um material comum para dispositivos microfluídicos.
Em outros sistemas considerados não tradicionais, sistema microfluídico baseado em gotículas, as microgotículas magnéticas podem ser um meio fácil de fabricação e controle de micro e nanomateriais, às vezes chamados de “robôs”. Essas nanoestruturas são formadas por nanopartículas magnéticas em microgotículas que foram manipuladas em estruturas específicas por um campo magnético aplicado. Microhelices são uma aplicação multifuncional desta tecnologia. Gotículas monodispersas contendo nanopartículas magnéticas são geradas e submetidas a um campo magnético que organiza as nanopartículas em um molde helicoidal que é fabricado no local por meio de polimerização fotoinduzida. Essas microhélices mostraram-se eficazes na limpeza de canais bloqueados com compostos semissólidos de gorduras, óleos e proteínas, como os encontrados nas artérias. As microhélices e os agrupamentos de micropartículas em gotículas magnéticas demonstraram ser um meio de transporte para micropartículas pequenas (500 µm de diâmetro), apresentando também aplicações na distribuição de fármacos. Microestruturas não esféricas também foram fabricadas usando microfluídica magnética, demonstrando o controle de minuto que está disponível. Entre as microestruturas não esféricas a serem fabricadas estavam microcápsulas de óxido de grafeno que poderiam ser aspiradas e reinfladas com uma micropipeta, ao mesmo tempo que exibiam comportamento fotorresponsivo e magnetorresponsivo. As microcápsulas que respondem a estímulos magnéticos e foto, como essas construídas de óxido de grafeno, são úteis para aplicações biomédicas que requerem manipulação in vivo , sem contato de estruturas celulares, como células-tronco.
Classificação de gotículas
A classificação de gotículas em microfluídica é uma técnica importante, permitindo a discriminação com base em fatores que variam do tamanho das gotículas a produtos químicos marcados com marcadores fluorescentes dentro da gota, decorrentes do trabalho realizado para classificar as células em citometria de fluxo . No domínio da classificação de gotículas, há dois tipos principais, classificação em massa, que usa métodos ativos ou passivos, e classificação precisa, que depende principalmente de métodos ativos. A classificação em massa é aplicada a amostras com um grande número de gotas (> 2000 s -1 ) que podem ser classificadas com base nas propriedades intrínsecas das gotas (como viscosidade, densidade, etc.) sem verificar cada gota. A classificação precisa, por outro lado, visa separar as gotas que atendem a certos critérios que são verificados em cada gota.
A classificação passiva é feita por meio do controle do projeto do canal microfluídico, permitindo a discriminação com base no tamanho da gota. A classificação por tamanho depende das junções bifurcadas no canal para desviar o fluxo, o que faz com que as gotículas sejam classificadas com base em como elas interagem com a seção transversal desse fluxo, a taxa de cisalhamento, que se relaciona diretamente com seu tamanho. Outros métodos passivos incluem inércia e microfiltração, cada um relacionado com as propriedades físicas, como inércia e densidade, da gota. A classificação ativa usa dispositivos adicionais anexados ao dispositivo microfluídico para alterar o caminho de uma gota durante o fluxo, controlando algum aspecto, incluindo controle térmico, magnético, pneumático, acústico, hidrodinâmico e elétrico. Esses controles são utilizados para classificar as gotículas em resposta a alguma detecção de sinal das gotículas, como a intensidade de fluorescência.
Métodos de classificação precisos utilizam esses métodos de classificação ativos, primeiro tomando uma decisão (por exemplo, sinal de fluorescência) sobre as gotículas, em seguida, alterando seu fluxo com um dos métodos acima mencionados. Foi desenvolvida uma técnica chamada Classificação de Gotículas Ativadas por Fluorescência (FADS), que utiliza classificação ativa induzida por campo elétrico com detecção fluorescente para classificar até 2.000 gotas por segundo. O método depende, mas não está limitado a, atividade enzimática de células alvo compartimentadas para ativar um substrato fluorogênico dentro da gota. Quando uma gota fluorescente é detectada, dois eletrodos são ligados aplicando um campo à gota, que muda seu curso para o canal de seleção, enquanto as gotas não fluorescentes fluem através do canal principal para o lixo. Outros métodos utilizam diferentes critérios de seleção, como absorbância de gotículas, número de partículas encapsuladas ou reconhecimento de imagem de formas celulares. A classificação pode ser feita para melhorar a pureza do encapsulamento, um fator importante para a coleta de amostras para experimentos futuros.
Aplicativos principais
Cultura de células
Uma das principais vantagens da microfluídica baseada em gotículas é a capacidade de usar gotículas como incubadoras para células individuais.
Dispositivos capazes de gerar milhares de gotículas por segundo abrem novos caminhos para caracterizar a população celular, não apenas com base em um marcador específico medido em um determinado momento, mas também com base no comportamento cinético das células, como secreção de proteínas, atividade enzimática ou proliferação. Recentemente, foi descoberto um método para gerar uma matriz estacionária de gotículas microscópicas para incubação de uma única célula que não requer o uso de um surfactante .
Cultura de células usando microfluídica à base de gotículas
Os sistemas microfluídicos baseados em gotículas fornecem uma plataforma analítica que permite o isolamento de células individuais ou grupos de células em gotículas. Esta ferramenta oferece alto rendimento para experimentos de células, uma vez que os sistemas microfluídicos baseados em gotículas podem gerar milhares de amostras (gotículas) por segundo. Em comparação com a cultura de células em placas de microtitulação convencionais , microgotículas de volumes de μL a pL reduzem o uso de reagentes e células. Além disso, o manuseio automatizado e o processamento contínuo permitem que os ensaios sejam realizados com mais eficiência. O ambiente isolado em uma gota encapsulada ajuda a analisar cada população de células individual. Os experimentos de cultura de células de alto rendimento, por exemplo, testar o comportamento de bactérias, encontrar tipos de células raros, evolução direcionada e triagem de células são adequados para usar as técnicas de microfluidos à base de gotículas.
Materiais, incubação e viabilidade
O polidimetilsiloxano (PDMS) é o material mais comum para fabricar dispositivos microfluídicos devido ao baixo custo, facilidade de prototipagem e boa permeabilidade a gases. Junto com os óleos carreadores de perfluorocarbono , que também permitem uma boa permeabilidade ao gás, usados como uma fase contínua no sistema microfluídico à base de gotículas para cultura de células, alguns estudos descobriram que a viabilidade celular é comparável à cultura em frascos, por exemplo, células de mamíferos. Para atingir o tempo de cultura necessário, pode-se usar um reservatório ou linha de retardo. O uso de um reservatório permite a cultura de longo prazo de várias horas a vários dias, enquanto a linha de retardo é adequada para cultura de curto prazo com vários minutos. A incubação é viável tanto no chip (reservatório conectado com um sistema microfluídico ou linhas de retardo) quanto fora do chip (tubulação de PTFE isolada com um sistema microfluídico) após a formação das gotas. Após a incubação, as gotículas podem ser reinjetadas no dispositivo microfluídico para análise. Existem também sistemas de armazenamento de gotículas no chip especialmente projetados para análise direta, como o dispositivo “dropspot”, que armazena gotículas em várias câmaras de array e usa scanner de microarray para análise direta.
Desafios
A cultura de células usando microfluídica baseada em gotículas criou muitas oportunidades de pesquisa que são inacessíveis em plataformas convencionais, mas também tem muitos desafios. Alguns dos desafios da cultura de células em microfluídicos à base de gotículas são comuns a outros sistemas de cultura de microfluidos. Primeiro, o consumo de nutrientes deve ser reavaliado para um sistema de microfluidos específico. Por exemplo, o consumo de glicose às vezes é aumentado em sistemas microfluídicos (dependendo do tipo de célula). O turnover do meio é às vezes mais rápido do que na cultura macroscópica devido aos volumes de cultura reduzidos, portanto, os volumes do meio usado devem ser ajustados em cada linha celular e dispositivo. Em segundo lugar, a proliferação celular e o comportamento podem diferir dependendo dos sistemas microfluídicos, um fator determinante é a área de superfície de cultura para o volume da mídia, que variam de um dispositivo para outro. Um relatório descobriu que a proliferação foi prejudicada nos microcanais; O aumento de glicose ou suplementação de soro não resolveu o problema para seu caso específico. Em terceiro lugar, a regulação do pH deve ser controlada. O PDMS é mais permeável ao CO 2 do que ao O 2 ou N 2 , portanto, o nível de gás dissolvido durante a incubação deve ser ajustado para atingir a condição de pH esperada.
Caracterização de macromoléculas biológicas
Cristalização de proteínas
Dispositivos baseados em gotículas também têm sido usados para investigar as condições necessárias para a cristalização de proteínas.
PCR baseado em gota
A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido uma ferramenta vital em genômica e esforços biológicos desde seu início, pois acelerou muito a produção e a análise de amostras de DNA para uma ampla gama de aplicações. O avanço tecnológico da PCR em escala de microgotículas permitiu a construção de um dispositivo PCR-on-a-chip de molécula única. A replicação inicial do DNA de uma única molécula , incluindo o que ocorre em microgotículas ou PCR de emulsão, era mais difícil do que a PCR em escala maior, portanto, concentrações muito mais altas de componentes eram geralmente usadas. No entanto, as condições totalmente otimizadas minimizaram essa sobrecarga, garantindo que moléculas únicas tenham uma concentração apropriada de componentes de replicação distribuídos por toda a célula de reação. O PCR microfluídico não baseado em gotículas também enfrenta desafios com a absorção de reagentes nos canais do dispositivo, mas os sistemas baseados em gotículas diminuem esse problema com a diminuição do contato do canal.
Usando sistemas de água em óleo, a PCR de gotículas opera reunindo ingredientes, formando gotículas, combinando gotículas, termociclando e, em seguida, processando os resultados de maneira muito semelhante à PCR normal. Esta técnica é capaz de executar mais de 2 milhões de reações de PCR, além de um aumento de 100.000 vezes na detecção de alelos de tipo selvagem sobre alelos mutantes . A PCR baseada em gotículas aumenta muito as capacidades de multiplexação da PCR normal - permitindo a produção rápida de bibliotecas de mutação. Sem a revisão, a replicação do DNA é inerentemente um tanto sujeita a erros, mas ao introduzir polimerases sujeitas a erros , a PCR baseada em gotículas utiliza uma saída de mutação maior do que o normal para construir uma biblioteca de mutação mais rápida e eficiente do que o normal. Isso torna o PCR baseado em gotículas mais atraente do que o PCR tradicional, mais lento. Em uma aplicação semelhante, a PCR de microgotículas altamente multiplexada foi desenvolvida para permitir a triagem de um grande número de sequências alvo, possibilitando aplicações como a identificação bacteriana. A PCR no chip permite um excesso de multiplexação de 15 x 15, o que significa que várias sequências de DNA alvo podem ser executadas no mesmo dispositivo ao mesmo tempo. Esta multiplexação foi possível com fragmentos de primer de DNA imobilizados colocados na base dos poços individuais dos chips.
A combinação de PCR baseado em gotículas com dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) permitiu novos aprimoramentos de PCR de gotículas, bem como remediar alguns problemas preexistentes com PCR de gotículas, incluindo alta perda de líquido devido à evaporação. A PCR baseada em gotículas é altamente sensível a bolhas de ar, pois elas criam diferenças de temperatura que dificultam a replicação do DNA e, ao mesmo tempo, desalojam os reagentes da câmara de replicação. Agora, a PCR baseada em gotículas foi realizada em dispositivos PDMS para transferir reagentes em gotículas através de uma camada de PDMS de uma maneira mais controlada que mantém melhor o progresso da replicação e a estabilidade do que as válvulas tradicionais. Um dispositivo PDMS de gota-gota recente permitiu maior precisão e amplificação de pequenos números de cópias em comparação com experimentos de PCR quantitativos tradicionais. Esta maior precisão foi devido ao PDMS dopado com surfactante, bem como um projeto de dispositivo de vidro-PDMS-vidro sanduíche. Essas propriedades do dispositivo permitiram uma iniciação mais simplificada do DNA e menos evaporação de água durante o ciclo de PCR.
Sequenciamento de DNA
Vários sistemas microfluídicos, incluindo sistemas baseados em gotículas, têm sido usados para o sequenciamento de DNA .
Evolução Dirigida
A microfluídica de gotículas tem sido usada para evolução direcionada . A evolução dirigida é um método usado para desenvolver novas proteínas, vias e genomas por meio de uma série de repetições de geração de biblioteca e subsequente triagem para obter um fenótipo desejado; isso permite aos cientistas criar proteínas sem conhecimento avançado da estrutura e funções das proteínas (ou seja, design racional ). Devido à natureza iterativa da evolução direcionada e à necessidade de grandes bibliotecas, a evolução direcionada na macroescala pode ser um empreendimento caro. Como tal, realizar experimentos em microescala por meio de microfluídicos baseados em gotículas fornece uma alternativa significativamente mais barata para equivalentes macroscópicos. Várias abordagens preço a evolução dirigida através de microfluidos de gota abaixo de $ 40 para uma tela de 10 6 -10 7 biblioteca de genes de tamanho, ao passo que a experiência correspondente macroescala custa cerca de $ 15 milhões. Além disso, com tempos de triagem que variam de 300 a 2000 gotículas classificadas por segundo, a microfluídica à base de gotículas fornece uma plataforma para triagem de biblioteca significativamente acelerada, de modo que bibliotecas de genes de 10 7 podem ser bem classificadas em um dia. Dispositivos microfluídicos baseados em gotículas tornam a evolução direcionada acessível e econômica.
Muitas abordagens diferentes para a construção de dispositivos de dispositivos microfluídicos baseados em gotículas foram desenvolvidas para a evolução direcionada, a fim de ter a capacidade de rastrear uma vasta variedade de diferentes proteínas, vias e genomas. Um método de alimentação de bibliotecas no dispositivo microfluídico usa encapsulamento de célula única, em que as gotículas contêm no máximo uma célula cada. Isso evita resultados confusos que poderiam ser gerados por ter várias células e, consequentemente, vários genótipos, em uma única gota, maximizando a eficiência do consumo de recursos. Este método permite a detecção de proteínas secretadas e proteínas na membrana celular. A adição de um lisado celular às gotículas, que quebra a membrana celular de modo que as espécies intracelulares estejam livremente disponíveis na gotícula, expande as capacidades do método de encapsulação de célula única para analisar proteínas intracelulares. A biblioteca também pode ser feita inteiramente in vitro (ou seja, não em seu contexto biológico / celular), de modo que o conteúdo da gota seja exclusivamente uma fita de DNA mutada. O sistema in vitro requer PCR e o uso de sistemas de transcrição e tradução in vitro (IVTT) para gerar a proteína desejada na gota para análise. A classificação de gotículas para evolução dirigida é feita principalmente por detecção de fluorescência (por exemplo, classificação de gota ativada por fluorescência (FADS)), no entanto, desenvolvimentos recentes em métodos de classificação com base em absorvância, conhecidos como classificação de gota ativada por absorvância (AADS), expandiram o diversidade de substratos que podem sofrer evolução direcionada por meio de um dispositivo microfluídico à base de gotículas. Recentemente, a capacidade de classificação foi até mesmo expandida para a detecção de níveis de NADPH e foi usada para criar oxidorredutases dependentes de NADP de atividade mais alta . Em última análise, o potencial para diferentes métodos de criação e análise de gotículas em dispositivos microfluídicos baseados em gotículas de evolução direcionada permite uma variabilidade que facilita uma grande população de candidatos potenciais para evolução direcionada.
Como um método para a engenharia de proteínas, a evolução dirigida tem muitas aplicações em campos que vão desde o desenvolvimento de medicamentos e vacinas até a síntese de alimentos e produtos químicos. Um dispositivo microfluídico foi desenvolvido para identificar hospedeiros de produção de enzimas aprimorados (ou seja, fábricas de células) que podem ser empregados industrialmente em vários campos. Uma aldolase artificial foi ainda aumentada em 30 vezes usando microfluídicos à base de gotículas de modo que sua atividade se assemelhava às proteínas de ocorrência natural. Mais recentemente, a criação de oxidases funcionais foi possibilitada por um novo dispositivo microfluídico criado por Debon et al. A abordagem microfluídica baseada em gotículas para a evolução direcionada tem um grande potencial para o desenvolvimento de uma miríade de novas proteínas.
Síntese química
A microfluídica à base de gotículas tornou-se uma ferramenta importante na síntese química devido a vários recursos atrativos. As reações em microescala permitem a redução de custos por meio do uso de pequenos volumes de reagentes, reações rápidas da ordem de milissegundos e transferência de calor eficiente que leva a benefícios ambientais quando a quantidade de energia consumida por unidade de aumento de temperatura pode ser extremamente pequena. O grau de controle sobre as condições locais dentro dos dispositivos muitas vezes torna possível selecionar um produto em detrimento de outro com alta precisão. Com alta seletividade de produto e tamanhos pequenos de reagentes e ambientes de reação, vêm uma limpeza de reação menos rigorosa e pegadas menores. As gotículas microdispersas criadas pela química à base de gotículas são capazes de atuar como ambientes nos quais ocorrem as reações químicas, como transportadores de reagentes no processo de geração de nanoestruturas complexas . As gotículas também são capazes de ser transformadas em estruturas semelhantes a células que podem ser usadas para imitar os componentes e processos biológicos dos humanos.
Como um método de síntese química , as gotas em dispositivos de microfluídica atuam como câmaras de reação individuais protegidas de contaminação por meio de entupimento do dispositivo pela fase contínua. Os benefícios da síntese usando este regime (em comparação com os processos em lote) incluem alto rendimento , experimentos contínuos, baixo desperdício, portabilidade e um alto grau de controle sintético. Alguns exemplos de sínteses possíveis são a criação de microesferas semicondutoras e nanopartículas . A detecção química é integrada ao dispositivo para garantir o monitoramento cuidadoso das reações, espectroscopia NMR , microscopia , detecção eletroquímica e detecção quimioluminescente são utilizadas. Freqüentemente, as medições são feitas em diferentes pontos ao longo do dispositivo microfluídico para monitorar o progresso da reação.
O aumento da taxa de reações usando microgotículas é visto na reação aldólica de éteres de silil enol e aldeídos . Usando um dispositivo microfluídico de base de gota , os tempos de reação foram encurtados para vinte minutos contra as vinte e quatro horas necessárias para um processo em lote. Outros experimentadores foram capazes de mostrar uma elevada selectividade de cis- estilbeno ao termodinamicamente favorecida trans -estilbeno em comparação com o lote de reacção, que mostra o elevado grau de controlo proporcionado por gotículas microreactor. Este controle estereoscópico é benéfico para a indústria farmacêutica. Por exemplo, L- metotrexato , um fármaco utilizado na quimioterapia, é mais prontamente absorvida do que o D isómero .
Microcápsulas de Cristal Líquido
A fabricação de cristais líquidos tem sido um ponto de intriga há mais de 5 décadas por suas propriedades anisotrópicas . Dispositivos microfluídicos podem ser usados para a síntese de cristais líquidos colestéricos confinados por meio de camadas de múltiplas camadas semelhantes a conchas consistindo em emulsões de óleo em água e água em óleo variáveis. A construção de cristais líquidos encapsulados através do fluxo microfluídico de gotículas de cristal líquido em um óleo imiscível permite a espessura da camada de emulsão monodispersa e a composição nunca vista antes do advento das técnicas microfluídicas. O advento da tecnologia de cristal líquido levou a avanços em visores ópticos usados em pesquisas e produtos de marca de consumo, mas as descobertas mais recentes abriram a porta para a combinação de combinação de fótons e conversão ascendente, bem como sensores ópticos para analitos biológicos.
Síntese de micropartículas e nanopartículas
Partículas avançadas e materiais à base de partículas, como partículas de polímero, microcápsulas , nanocristais e aglomerados ou grânulos de cristal fotônico podem ser sintetizados com o auxílio de microfluídicos à base de gotículas. Nanopartículas , como nanopartículas de núcleo-casca coloidal CdS e CdS / CdSe, também podem ser sintetizadas por meio de várias etapas em uma escala de tempo de milissegundos em um sistema baseado em gotículas microfluídicas.
Nanopartículas, micropartículas e aglomerados coloidais em dispositivos microfluídicos são úteis para funções como a administração de drogas. As primeiras partículas incorporadas em sistemas baseados em gotículas foram os géis de sílica na faixa de tamanho micrométrico para testar suas aplicações na fabricação de displays e revestimentos ópticos. A mistura de partículas sólidas com microgotículas aquosas requer mudanças nos canais microfluídicos, como misturas de reagentes adicionais e escolha de materiais específicos, como sílica ou polímeros, que não interferem com os canais e quaisquer substâncias bioativas que as gotículas contenham.
A síntese de copolímeros requer a moagem de moléculas macroscópicas em micropartículas com superfícies porosas e irregulares usando solventes orgânicos e técnicas de emulsificação. Essas gotículas pré-carregadas com micropartículas também podem ser rapidamente processadas usando irradiação UV. A caracterização dessas micropartículas e nanopartículas envolve microimagem para análise da estrutura e identificação do material macroscópico sendo moído. Técnicas como o encapsulamento controlado de bolhas de gás individuais para criar nanopartículas ocas para sintetizar microbolhas com conteúdos específicos são vitais para sistemas de entrega de drogas. As micropartículas à base de sílica e titânio são usadas como invólucros duráveis após o uso de gás para aumentar a velocidade do fluxo da fase aquosa. Uma velocidade de fluxo mais alta permite maior controle sobre a espessura das conchas aquosas. A versatilidade emergente das nanopartículas pode ser vista na distribuição de microgotículas carregadas com partículas sendo utilizadas em injeções de depósito para distribuição de drogas, em vez da abordagem típica de injeção intravenosa de drogas . Isso é possível devido à baixa espessura dos invólucros, que normalmente estão na faixa de 1 a 50 µm.
Avanços mais recentes em partículas microfluídicas permitiram a síntese de partículas de tamanho nanométrico a partir de polímeros derivados biologicamente. Usando projetos multifásicos de foco de fluxo específicos que controlam a taxa de fluxo e a temperatura, o tamanho da formação de nanopartículas pode ser controlado junto com a concentração e a configuração das gotículas. Outra técnica para criar microgotículas carregadas de partículas é o uso de nanopartículas de hidrogel-lipídio que podem ser manipuladas em gotículas de formato mais estreito, o que é útil quando materiais moles ou quebradiços devem ser usados. Esses materiais macios são especialmente importantes na produção de pós . Avanços recentes na nanoescala, como dispositivos que fabricam gotículas esféricas e não esféricas que são ultra-rápidas e homogêneas misturadas, estão sendo produzidos para produção em larga escala de partículas em pó em aplicações industriais.
Nanopartículas monodispersas também são de grande interesse na fabricação de catalisadores . A eficiência de muitos sistemas catalíticos heterogêneos depende de altas áreas de superfície de partículas de metal de transição. Técnicas microfluídicas têm sido usadas para fabricar nanopartículas de ouro por meio da interação interfacial de gotículas contendo cloreto de ouro, hexano e um agente redutor com uma fase aquosa circundante. Este processo também pode controlar o tamanho e a forma das nanopartículas / nanofolhas com precisão e alto rendimento em comparação com outros métodos, como a deposição física de vapor .
O uso de gotículas contendo vários materiais, como sílica ou metais de transição, como ouro fluindo através de uma fase de óleo imiscível, demonstrou ser eficaz no controle do tamanho das nanopartículas e do tamanho dos poros, o que permite o projeto de dispositivos de captura de gás eficientes e catalisadores heterogêneos. Nanopartículas monodispersas de ouro e prata foram sintetizadas usando gotículas de ouro e cloreto de prata doseadas com um agente redutor para clivar ligações metal-ligante, levando à aglomeração de nanopartículas de metal monodispersas que podem ser facilmente filtradas da solução.
Síntese de Partículas de Gel
A síntese de partículas de gel, também conhecidas como hidrogéis, microgéis e nanogéis, tem sido uma área de interesse de pesquisadores e indústrias nas últimas décadas. Uma abordagem baseada em microfluidos para sintetizar essas partículas de hidrogel é uma ferramenta útil, devido ao alto rendimento, monodispersidade de partículas e redução de custos por meio do uso de pequenos volumes de reagentes. Um dos principais desafios no início do campo de géis foi a formação de partículas monodispersas. Inicialmente, técnicas baseadas em polimerização foram usadas para formar micropartículas em massa que eram polidispersas em tamanho. Essas técnicas geralmente eram centradas no uso de uma solução aquosa que era misturada vigorosamente para criar emulsões. Eventualmente, uma técnica foi desenvolvida para criar microgéis biodegradáveis monodispersos, fazendo emulsões O / W em uma geometria de canal de geração de gotículas em linha. Essa geometria de junção, acompanhada de uma fase contínua carregada de surfactante, foi responsável pela criação de microgéis feitos de poli-dex-HEMA. Outras geometrias de dispositivo, incluindo a formação de estilo de junção em T, também são viáveis e têm sido usadas para fazer géis à base de sílica.
Uma vez que esses métodos foram estabelecidos, os esforços se concentraram na aplicação de funcionalidade a essas partículas. Os exemplos incluem partículas encapsuladas por bactérias, partículas encapsuladas por fármacos ou proteínas e partículas de gel magnético. Inserir esses componentes funcionais na estrutura do gel pode ser tão simples quanto integrar o componente na fase dispersa. Em alguns casos, certas geometrias de dispositivo são preferidas, por exemplo, uma junção de foco de fluxo foi usada para encapsular bactérias em micropartículas de agarose. Emulsões múltiplas são de interesse para aplicações farmacêuticas e cosméticas e são formadas usando duas junções de foco de fluxo consecutivas. Partículas mais complicadas também podem ser sintetizadas, como partículas de Janus, que têm superfícies com duas ou mais propriedades físicas distintas.
Alguns exemplos da aplicação crescente de partículas de gel incluem entrega de drogas, aplicações biomédicas e engenharia de tecidos, e muitas dessas aplicações requerem partículas monodispersas onde uma abordagem baseada em microfluídica é preferida. Métodos de emulsificação em massa ainda são relevantes, já que nem todas as aplicações requerem micropartículas uniformes. O futuro da síntese microfluídica de géis pode estar no desenvolvimento de técnicas para criar grandes quantidades dessas partículas uniformes, a fim de torná-las mais comercialmente / industrialmente disponíveis.
Desenvolvimentos recentes em microfluídicos de gotículas também permitiram a síntese in situ de fibras de hidrogel contendo gotículas aquosas com morfologia controlada. As fibras de hidrogel fornecem uma opção intrigante de material biocompatível para distribuição de drogas e bioimpressão de materiais que podem imitar o comportamento de uma matriz extracelular. Este método microfluídico difere da rota de síntese tradicional por fiação úmida através do uso de gotículas aquosas em uma corrente de óleo imiscível, em vez da extrusão de uma solução a granel da mesma composição misturada fora do local. A capacidade de controlar o tamanho, a taxa de fluxo e a composição das gotículas oferece uma opção para ajustar a morfologia das fibras para se adequar a um uso específico em bioanálise e emulação de funções anatômicas.
Extração e transferência de fase usando microfluídica de gotícula
A extração líquido-líquido é um método usado para separar um analito de uma mistura complexa; com este método, os compostos são separados com base em sua relativa solubilidade em diferentes fases líquidas imiscíveis. Para superar algumas das desvantagens associadas aos métodos de bancada comuns, como o método do frasco agitado, métodos de extração líquido-líquido microfluídicos têm sido empregados. Os sistemas baseados em gotículas microfluídicas demonstraram a capacidade de manipular volumes discretos de fluidos em fases imiscíveis com baixos números de Reynolds. e regimes de fluxo laminar. Os métodos em microescala reduzem o tempo necessário, reduzem o volume da amostra e do reagente e permitem a automação e integração. Em alguns estudos, o desempenho da extração microfluídica à base de gotículas se compara intimamente com o método do frasco agitado. Estudo que comparou os métodos de extricação em frasco agitado e líquido-líquido microfluídico para 26 compostos e encontrou estreita correlação entre os valores obtidos (R2 = 0,994).
Também foi demonstrado que os dispositivos de extração líquido-líquido microfluídico podem ser integrados a outros instrumentos para detecção dos analitos extraídos. Por exemplo, a extração microfluídica pode ser usada para extrair um analito inicialmente em uma fase aquosa, como cocaína na saliva, em seguida, interfaceado com espectroscopia IR no chip para detecção. A extração microfluídica líquido-líquido demonstrou ser vantajosa em várias aplicações, como estudos de drogas farmacocinéticas, onde apenas um pequeno número de células é necessário, e em estudos adicionais, onde volumes menores de reagentes são necessários.
Detecção de gotículas
Métodos de separação
Sistemas microfluídicos baseados em gotículas podem ser acoplados a métodos de separação para tarefas específicas. As técnicas de separação comuns acopladas a sistemas microfluídicos baseados em gotículas incluem cromatografia líquida de alto desempenho ( HPLC ) e eletroforese .
Cromatografia líquida de alta performance
Muitas formas de cromatografia, incluindo cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia líquida de ultra desempenho de nanofluxo (nano-UPLC ou nano-LC) e cromatografia de fluxo capilar bidimensional (LC capilar), foram integradas ao campo de microfluídica baseada em gotas. Na microescala, técnicas de separação química como HPLC podem ser usadas em análises biológicas e químicas. No campo da microfluídica, essas técnicas têm sido aplicadas a sistemas microfluídicos em três diferentes estágios do processo microfluídico. As colunas de HPLC fora do chip são usadas para separar analitos antes de alimentá-los em um dispositivo microfluídico para fracionamento e análise. As colunas de HPLC também podem ser construídas diretamente em chips de laboratório microfluídicos, criando dispositivos híbridos monolíticos capazes de separação química, bem como formação e manipulação de gotículas. Além disso, o HPLC é usado na extremidade final da química microfluídica baseada em gotículas como uma forma de purificar, analisar e / ou quantificar os produtos de um experimento.
Dispositivos microfluídicos baseados em gotículas acoplados a HPLC têm alta sensibilidade de detecção, usam baixos volumes de reagentes, têm tempos de análise curtos e contaminação cruzada mínima de analitos, o que os torna eficientes em muitos aspectos. No entanto, ainda existem problemas associados à cromatografia em microescala, como dispersão de bandas separadas, difusão e “volume morto” em canais após a separação. Uma maneira de contornar esses problemas é o uso de gotículas para compartimentar as bandas de separação, o que combate a difusão e a perda de analitos separados. Nas primeiras tentativas de integrar cromatografia com microfluídica de gotícula, as taxas de fluxo e pressões mais baixas necessárias para o LC capilar 2-D forneceram menos obstáculos a serem superados na combinação dessas tecnologias e tornaram possível acoplar várias técnicas de separação 2-D em um dispositivo ( ou seja, HPLC x LC , LC x LC e HPLC x HPLC). Os amostradores automáticos de HPLC que alimentam dispositivos microfluídicos têm aproveitado a dispersão que ocorre entre a separação e a formação de gotículas para alimentar pulsos de gradiente de analitos em dispositivos microfluídicos onde a produção de milhares de gotículas de pico-litro captura concentrações de analito únicas. Abordagens semelhantes usaram as capacidades de retirada de uma bomba de seringa para alinhar as taxas de fluxo relativamente altas necessárias para HPLC com as taxas de fluxo mais baixas do meio contínuo comum em dispositivos microfluídicos. O desenvolvimento de nano-LC, ou nano-UPLC, forneceu outra oportunidade para o acoplamento com dispositivos microfluídicos, de modo que grandes bibliotecas de gotículas podem ser formadas com múltiplas dimensões de informações sendo armazenadas em cada gotícula. Em vez de identificar picos e armazená-los como uma única amostra, como visto no LC padrão, essas bibliotecas de gotículas permitem que a concentração específica do analito seja retida junto com sua identidade. Além disso, a capacidade de realizar o fracionamento de alta frequência imediatamente do eluente de uma coluna nano-LC aumentou muito a resolução do pico e melhorou a qualidade geral de separação em comparação com dispositivos nano-LC de fluxo contínuo.
Uma coluna de HPLC foi primeiro construída diretamente em um dispositivo microfluídico usando TPE em vez de PDMS para a fabricação do dispositivo. A força adicional do TPE o tornou capaz de suportar as pressões mais altas necessárias para HPLC, de modo que um único chip de laboratório microfluídico pudesse realizar a separação química, o fracionamento e a manipulação adicional de gotículas. A fim de aumentar a qualidade da produção cromatográfica, dispositivos mais robustos feitos de vidro mostraram a capacidade de suportar uma pressão muito maior do que o TPE. Alcançar essas pressões mais altas para aumentar o grau de separação e eliminar todos os volumes mortos por meio da formação imediata de gotículas mostrou o potencial da microfluídica de gotícula para expandir e melhorar os recursos de separações por HPLC.
Eletroforese
Eletroforese capilar (CE) e eletroforese em gel microcapilar (μCGE) são métodos de eletroforese microchip (MCE) bem reconhecidos que podem fornecer inúmeras vantagens analíticas, incluindo alta resolução, alta sensibilidade e acoplamento eficaz à espectrometria de massa (MS). A eletroforese de microchip pode ser aplicada geralmente como um método para processos de triagem de alto rendimento que ajudam a descobrir e avaliar drogas. Usando MCE, especificamente CE, dispositivos de eletroforese em gel microcapilar (μCGE) são criados para realizar o processamento de amostras de DNA de alto número, o que o torna um bom candidato para análise de DNA. Os dispositivos μCGE também são práticos para fins de separação porque usam separação, caracterização, encapsulamento e seleção on-line de analitos diferentes originados de uma amostra composta. Todas essas vantagens dos métodos MCE se traduzem em dispositivos microfluídicos. A razão pela qual os métodos MCE são acoplados a dispositivos microfluídicos à base de gotículas é por causa da capacidade de analisar amostras na escala de nanolitro. O uso de métodos MCE em pequena escala reduz o custo e o uso de reagentes. Similarmente ao HPLC, técnicas de detecção baseadas em fluorescência são usadas para eletroforese capilar, o que torna esses métodos práticos e podem ser aplicados em campos como biotecnologia, química analítica e desenvolvimento de medicamentos. Esses MCE e outros métodos baseados em eletroforese começaram a se desenvolver quando a eletroforese capilar ganhou popularidade na década de 1980 e ganhou ainda mais atenção no início da década de 1990, quando foi revisada quase 80 vezes no ano de 1992.
A espectrometria de massa ( MS ) é uma técnica de detecção quase universal, reconhecida em todo o mundo como o padrão ouro para a identificação de muitos compostos. MS é uma técnica analítica na qual as espécies químicas são ionizadas e classificadas antes da detecção, e o espectro de massa resultante é usado para identificar as moléculas parentais dos íons. Isso torna o MS, ao contrário de outras técnicas de detecção (como fluorescência), isento de marcadores; isto é, não há necessidade de ligar ligantes ou grupos adicionais à molécula de interesse para receber um sinal e identificar o composto.
Espectrometria de massa
A espectrometria de massa (MS) é uma técnica de detecção quase universal, reconhecida em todo o mundo como o padrão ouro para a identificação de muitos compostos. MS é uma técnica analítica na qual as espécies químicas são ionizadas e classificadas antes da detecção, e o espectro de massa resultante é usado para identificar as moléculas parentais dos íons. Isso torna o MS, ao contrário de outras técnicas de detecção (como fluorescência ), isento de marcadores; isto é, não há necessidade de ligar ligantes ou grupos adicionais à molécula de interesse para receber um sinal e identificar o composto.
Existem muitos casos em que outros métodos espectroscópicos, como ressonância magnética nuclear ( NMR ), fluorescência , infravermelho ou Raman , não são viáveis como métodos autônomos devido à composição química particular das gotículas. Freqüentemente, essas gotículas são sensíveis a rótulos fluorescentes ,]] ou contêm espécies que são indeterminadamente semelhantes, onde MS pode ser empregado junto com outros métodos para caracterizar um analito específico de interesse. [56] [57] No entanto, o MS só recentemente (na última década) ganhou popularidade como um método de detecção para microfluídicos baseados em gotículas (e microfluídicos como um todo) devido aos desafios associados ao acoplamento de espectrômetros de massa com esses dispositivos miniaturizados. A dificuldade de separação / purificação torna os sistemas de escala totalmente microfluídicos acoplados à espectrometria de massa ideais nos campos da proteômica,]] [58] [59] cinética enzimática, [60] descoberta de drogas [37] e triagem de doenças neonatais. [61] Os dois métodos principais de ionização para análise de massa usados em microfluídica baseada em gotículas hoje são dessorção / ionização a laser assistida por matriz ( MALDI ) [62] [63] e ionização por eletrospray ( ESI ).]] Métodos adicionais para acoplamento, como (mas não se limitando a) nebulização de onda acústica de superfície ( SAWN ) e ionização por spray de papel em MS miniaturizado também estão sendo desenvolvidos. [64]
Ionização por electrospray
Uma complicação oferecida pelo acoplamento de MS a microfluídicos à base de gotículas é que as amostras dispersas são produzidas em taxas de fluxo comparativamente baixas em comparação com as técnicas tradicionais de injeção de MS. O ESI é capaz de aceitar facilmente essas baixas taxas de fluxo e agora é comumente explorado para análises microfluídicas on-line. ESI e MALDI oferecem uma resposta de alto rendimento para o problema de detecção de gotas sem rótulo, mas ESI requer menos preparação intensiva de amostra e elementos de fabricação que são escalonáveis para escala de dispositivo microfluídico. [68] ESI envolve a aplicação de uma alta voltagem a um fluxo portador de gotículas contendo analito, que aerossoliza o fluxo, seguido pela detecção em uma região potencial diferenciada do analisador. O fluido transportador dentro de um dispositivo microfluídico à base de gotículas, normalmente um óleo, é muitas vezes um obstáculo dentro do ESI. O óleo, quando parte do fluxo de gotículas que vai para um instrumento ESI-MS, pode causar uma tensão de fundo constante, interferindo na detecção de gotículas de amostra. Esta interferência de fundo pode ser retificada mudando o óleo usado como fluido transportador e ajustando a voltagem usada para o eletrospray.
O tamanho da gota, o formato do cone de Taylor e a taxa de fluxo podem ser controlados variando o diferencial potencial e a temperatura de uma corrente de gás de secagem (para evaporar o analito-solvente circundante) (geralmente nitrogênio). [69] Como o ESI permite a detecção de gotículas online, outros problemas apresentados por sistemas baseados em detecção segmentada ou fora do chip podem ser resolvidos, como a minimização da diluição da amostra (gota), que é especialmente crítica para a detecção de gotículas microfluídicas onde as amostras de analito são já diluído para a concentração experimentalmente relevante mais baixa. [70]
Dessorção / ionização de laser assistida por matriz
MALDI é tipificado pelo uso de um laser ultravioleta ( UV ) para desencadear a ablação de espécies de analito que são misturadas com uma matriz de moléculas cristalizadas com alta absorção óptica. Os íons dentro dos gases eliminados resultantes são então protonados ou desprotonados antes da aceleração em um espectrômetro de massa. As vantagens primárias de detecção MALDI mais ESI em dispositivos de microfluidos são que MALDI permite muito mais fácil de multiplexagem , [65] que mesmo aumentos adicionais global do dispositivo de rendimento , [63] , bem como uma menor dependência de partes móveis, e a ausência de Taylor cone problemas de estabilidade apresentados por taxas de fluxo em escala microfluídica. [66] A velocidade de detecção de MALDI, juntamente com a escala de gotículas microfluídicas, permite melhorias nas técnicas de macroescala em resolução de rendimento e tempo de voo ( TOF ). [60] [63] Onde as configurações de detecção de MS típicas frequentemente utilizam técnicas de separação, como cromatografia, as configurações de MALDI requerem uma amostra suficientemente purificada para ser misturada com matrizes orgânicas pré-determinadas, adequadas para a amostra específica, antes da detecção. [58] A composição da matriz MALDI deve ser ajustada para produzir a fragmentação e ablação adequadas dos analitos.
Um método para obter uma amostra purificada de microfluídicos à base de gotículas é terminar o canal microfluídico em uma placa MALDI, com gotículas aquosas se formando em regiões hidrofílicas na placa. O solvente e o fluido de transporte são então permitidos a evaporar, deixando para trás apenas as gotículas secas da amostra de interesse, após o que a matriz MALDI é aplicada às gotículas secas. Esta preparação de amostra tem limitações e complicações notáveis, que atualmente não são superadas para todos os tipos de amostras. Além disso, as matrizes MALDI estão preferencialmente em concentrações muito mais altas do que a amostra de analito, o que permite que o transporte de gotículas microfluídicas seja incorporado na produção online da matriz MALDI. Devido ao baixo número de matrizes conhecidas e à natureza de tentativa e erro para encontrar novas composições de matriz apropriadas, [67] este pode ser o fator determinante no uso de outras formas de espectroscopia sobre MALDI.
Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman é uma técnica espectroscópica que fornece análise não destrutiva capaz de identificar componentes em misturas com especificidade química sem preparação complexa de amostras. A espectroscopia Raman se baseia no espalhamento de fótons após a radiação de luz visível, onde a mudança nas energias dos fótons corresponde às informações sobre os modos vibracionais do sistema e suas frequências. Ao obter frequências de modo vibracional , classificações qualitativas sobre o sistema podem ser feitas e reforçadas.
A espectroscopia Raman funciona bem em paralelo com dispositivos microfluídicos para muitas aplicações biológicas qualitativas. Para algumas aplicações, a espectroscopia Raman é preferível a outros métodos de detecção, como a espectroscopia de infravermelho (IR), pois a água tem um forte sinal de interferência com IR, mas não com Raman. Da mesma forma, métodos como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), ressonância magnética nuclear (NMR), espectrometria de massa (MS) ou cromatografia gasosa (GC) também não são ideais, pois esses métodos requerem tamanhos de amostra maiores. Uma vez que a microfluídica permite experimentos com pequenos volumes (incluindo a análise de células únicas ou poucas células), Raman é um método de detecção microfluídica líder. Especificamente, a integração Raman com dispositivos microfluídicos tem fortes aplicações em sistemas onde a identificação de lipídios é necessária, comum na pesquisa de biocombustíveis . Por exemplo, um ensaio de fluorescência de lipídio não é seletivo o suficiente e, portanto, não pode identificar diferenças moleculares da maneira que Raman pode por meio de vibrações moleculares. Raman, quando acoplado a dispositivos microfluídicos, também pode monitorar a mistura de fluido e aprisionamento de líquidos e também pode detectar fases sólidas e gasosas dentro de plataformas microfluídicas, uma capacidade que é aplicável ao estudo da solubilidade gás-líquido.
A espectroscopia Raman em dispositivos microfluídicos é aplicada e detectada usando fibra óptica integrada em um chip microfluídico ou colocando o dispositivo em um microscópio Raman . Além disso, alguns sistemas microfluídicos utilizam colóide metálico ou nanopartículas em solução para capitalizar a espectroscopia Raman de superfície aprimorada (SERS). O SERS pode melhorar o espalhamento Raman por até um fator de 10 11 , formando complexos de transferência de carga nas superfícies. Conclui-se que esses dispositivos são comumente fabricados com membranas de policarbonato nanoporoso , permitindo o fácil revestimento das nanopartículas . No entanto, se fabricado em polidimetilsiloxano (PDMS), pode ocorrer interferência de sinal com o espectro Raman. O PDMS gera um sinal Raman forte que pode facilmente sobrepujar e interferir com o sinal desejado. Uma solução comum para isso é fabricar o dispositivo microfluídico de forma que um orifício confocal possa ser usado para o laser Raman. A microscopia confocal Raman típica permite informações espectroscópicas de pequenos volumes focais com menos de 1 mícron ao cubo e, portanto, menores do que as dimensões do canal microfluídico. O sinal Raman é inerentemente fraco; portanto, para tempos de detecção curtos em pequenos volumes de amostra em dispositivos microfluídicos, a amplificação de sinal é utilizada. A espectroscopia Raman multi-fótons, como a espectroscopia Raman estimulada (SRS) ou a espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) ajudam a melhorar os sinais de substâncias em dispositivos microfluídicos.
Para microfluídicos baseados em gotículas, a detecção Raman fornece análise online de vários analitos dentro de gotículas ou fase contínua. O sinal Raman é sensível a mudanças de concentração, portanto, a solubilidade e a cinética de mistura de um sistema microfluídico à base de gotículas podem ser detectadas usando Raman. As considerações incluem a diferença do índice de refração na interface da gota e da fase contínua, bem como entre as conexões de fluido e de canal.
Detecção fluorescente
A espectroscopia de fluorescência é uma das técnicas de detecção de gotículas mais comuns. Ele fornece uma resposta rápida e, para analitos aplicáveis, tem um sinal forte. O uso de espectroscopia de fluorescência em microfluídica segue um formato semelhante à maioria das outras técnicas analíticas fluorescentes. Uma fonte de luz é usada para excitar as moléculas de analito na amostra, após o que o analito fica fluorescente e a resposta de fluorescência é a saída medida. As câmeras podem ser usadas para capturar o sinal de fluorescência das gotículas, e os filtros são freqüentemente usados para filtrar a luz de excitação espalhada. Na detecção de gotículas microfluídicas, a configuração experimental de um instrumento de fluorescência pode variar muito. Uma configuração comum na detecção de gotículas fluorescentes é com o uso de um microscópio de epifluorescência . Isso às vezes utiliza uma geometria confocal, que pode variar dependendo das necessidades experimentais. Por exemplo, Jeffries et al. relatou sucesso com a exploração de uma geometria confocal ortogonal, em oposição a uma geometria epi padrão. No entanto, outras configurações para detecção de fluorescência foram exploradas, pois os microscópios de epifluorescência podem ser caros e difíceis de manter. Cole et al. propuseram e testaram uma configuração experimental com fibra óptica para realizar análises de fluorescência de gotículas microfluídicas.
A detecção de fluorescência de gotículas tem uma série de vantagens. Em primeiro lugar, ele pode acomodar um rendimento grande e rápido. A análise de milhares de amostras pode ser realizada em um curto período de tempo, o que é vantajoso para a análise de um grande número de amostras. Outra vantagem é a precisão do método. Em uma análise realizada por Li et al., Verificou-se que o uso de técnicas de detecção de fluorescência rendeu 100% de precisão de detecção em 13 das 15 imagens coletadas. Os dois restantes tiveram erros relativos em torno de 6%. Outra vantagem da detecção de fluorescência é que ela permite a análise quantitativa do espaçamento das gotas em uma amostra. Isso é feito pelo uso de medições temporais e da velocidade de fluxo do analito. O espaçamento de tempo entre os sinais permite o cálculo do espaçamento das gotas. A análise de fluorescência adicional de amostras de gotículas microfluídicas pode ser usada para medir o tempo de vida fluorescente das amostras, fornecendo informações adicionais que não podem ser obtidas apenas para medições de intensidade de fluorescência.
As aplicações da detecção de fluorescência são variadas, com muitos de seus usos centrados em aplicações biológicas. Frenz et al. utilizou detecção de fluorescência de gotículas para examinar a cinética da enzima. Para este experimento, a b-lactamase interagiu com a fluorocilina, um substrato fluorogênico. A fluorescência das gotículas foi medida em vários intervalos de tempo para examinar a mudança com o tempo. No entanto, este método de detecção vai além das aplicações biológicas e permite o estudo físico da formação e evolução das gotículas. Por exemplo, Sakai et al. usou a detecção de fluorescência para monitorar o tamanho das gotas. Isso foi feito coletando dados de fluorescência para calcular a concentração de um corante fluorescente em uma única gota, permitindo assim que o crescimento do tamanho seja monitorado. O uso de técnicas de detecção de fluorescência pode ser expandido para aplicações além da coleta de dados; um método amplamente utilizado de classificação de células e gotas em microfluídica é a classificação ativada por fluorescência, em que as gotas são classificadas em diferentes canais ou pontos de coleta com base em sua intensidade de fluorescência.
Pontos quânticos fluorescentes têm sido usados para desenvolver plataformas de biossensor e distribuição de drogas em dispositivos microfluídicos. Os pontos quânticos são úteis devido ao seu tamanho pequeno, comprimento de onda de excitação preciso e alto rendimento quântico . São vantagens em relação aos corantes tradicionais que podem interferir na atividade do composto estudado. No entanto, a criação em massa e a conjugação de pontos quânticos com moléculas de interesse continuam sendo um desafio. Dispositivos microfluídicos que conjugam nucleotídeos com pontos quânticos foram projetados para resolver esse problema, reduzindo significativamente o tempo de conjugação de dois dias para minutos. Os conjugados DNA-quantum dot são importantes para detectar DNA e miRNA complementares em sistemas biológicos.
Detecção eletroquímica
A detecção eletroquímica serve como uma alternativa barata não apenas para medir a composição química em certos casos, mas também o comprimento da gota, a frequência, a condutividade e a velocidade em altas velocidades e geralmente com muito pouca compensação de espaço no chip. O método foi discutido pela primeira vez em Luo et al. em que a equipe foi capaz de medir com sucesso o tamanho e a concentração de íons em gotículas de pico-litro contendo íons NaCl dissolvidos. Geralmente é realizado com um conjunto ou série de microeletrodos que medem as perturbações da corrente, gotas menores gerando perturbações menores, enquanto gotas maiores gerando curvas mais longas. O número de perturbações na corrente também pode indicar a frequência das gotas que passam pelo eletrodo como forma de determinar a taxa de gotas também. Vários compostos diferentes têm sido sugeridos para uso dentro dos eletrodos, pois leituras exatas, precisas e significativas podem ser difíceis na microescala. Esses compostos variam de eletrodos de pasta de carbono, que são aplicados diretamente no chip, a preto de platina eletrodepositado em fio de platina em conjunto com cloreto de prata em microeletrodo de prata para aumentar a atividade e a área de superfície.
Quanto à composição química, as leituras são obtidas por meio de análise cronoamperométrica de compostos eletroativos dentro das gotículas, conforme indicado acima. O potencial varia de acordo com os íons eletricamente viáveis, íons de sódio e cloro dissolvidos neste experimento e suas concentrações dentro de cada gota. Outro grupo exibiu, com uma série de controles, que a composição de gotículas mistas envolvendo iodeto de potássio foi detectada com precisão na escala de tempo de segundos com voltagem, velocidade e faixas de pH ideais. Além disso, uma abordagem mais exclusiva está se desenvolvendo nas leituras cronoamperométricas, onde sistemas magneto-fluídicos foram criados e as leituras de potencial são medidas em fluidos eletroinativos pela dissolução de micropartículas magnéticas no reagente. Este método é aprimorado em uma configuração microfluídica digital (DMF), onde eletrodos de ouro e prata em junção com micropartículas magnéticas dissolvidas nos fluidos substituíram a detecção de gotículas baseada em fluorescência típica no imunoensaio de analitos biomarcadores.
O experimento acima de Shamsi et al, alude ao uso principal para detecção eletroquímica em microfluídica; biossensorização para várias medições, como cinética enzimática e ensaios biológicos de muitos outros tipos de células. É necessário um maior controle do sistema para esses processos, pois com o aumento da taxa de fluxo, a detecção da enzima diminui. Embora à medida que uma reação enzimática progride, a leitura amperométrica também evolui, permitindo um rápido monitoramento da cinética. Além disso, surfactantes específicos podem não ter biocompatibilidade com o sistema, afetando a enzima e a detecção de distorção. Os alcances dessa aplicação tiveram efeitos até mesmo na aquicultura e na economia, já que a detecção eletroquímica foi usada para testar rapidamente o frescor dos peixes. A utilização deste método de detecção encontra-se principalmente no eletroumectação de DMFs dieléctricas, onde o aparelho de eléctrodo de detecção pode ser reconfigurável e tem um tempo de vida mais longo ao mesmo tempo que ainda produz resultados precisos.