Microscopia confocal - Confocal microscopy

Microscopia Confocal
Malha D018613
Código OPS-301 3-301
Princípio de funcionamento dos microscópios de fluorescência e confocal

A microscopia confocal , mais frequentemente microscopia confocal de varredura a laser ( CLSM ) ou microscopia de varredura confocal a laser ( LCSM ), é uma técnica de imagem óptica para aumentar a resolução óptica e o contraste de uma micrografia por meio do uso de um orifício espacial para bloquear a luz fora de foco na formação da imagem. Capturar várias imagens bidimensionais em diferentes profundidades em uma amostra permite a reconstrução de estruturas tridimensionais (um processo conhecido como corte óptico ) dentro de um objeto. Esta técnica é amplamente utilizada nas comunidades científica e industrial e as aplicações típicas são em ciências da vida , inspeção de semicondutores e ciência de materiais .

A luz viaja através da amostra sob um microscópio convencional tão longe quanto ela pode penetrar na amostra, enquanto um microscópio confocal focaliza apenas um feixe menor de luz em um nível de profundidade estreito de cada vez. O CLSM atinge uma profundidade de campo controlada e altamente limitada.

Conceito básico

Princípio do sensor de ponto confocal da patente de Minsky
Proteína de fusão GFP sendo expressa em Nicotiana benthamiana . A fluorescência é visível por microscopia confocal.

O princípio da imagem confocal foi patenteado em 1957 por Marvin Minsky e visa superar algumas limitações dos microscópios de fluorescência de campo amplo tradicionais . Em um microscópio de fluorescência convencional (isto é, campo amplo) , toda a amostra é inundada uniformemente com a luz de uma fonte de luz. Todas as partes da amostra podem ser excitadas ao mesmo tempo e a fluorescência resultante é detectada pelo fotodetector ou câmera do microscópio, incluindo uma grande parte de fundo desfocada. Em contraste, um microscópio confocal usa iluminação pontual (consulte Função de propagação de ponto ) e um orifício em um plano opticamente conjugado na frente do detector para eliminar o sinal fora de foco - o nome "confocal" deriva dessa configuração. Como apenas a luz produzida por fluorescência muito próxima ao plano focal pode ser detectada, a resolução óptica da imagem , particularmente na direção da profundidade da amostra, é muito melhor do que a dos microscópios de campo amplo. No entanto, como grande parte da luz da fluorescência da amostra é bloqueada no orifício, esse aumento de resolução ocorre às custas da diminuição da intensidade do sinal - portanto, exposições longas são frequentemente necessárias. Para compensar essa queda no sinal após o orifício , a intensidade da luz é detectada por um detector sensível, geralmente um tubo fotomultiplicador (PMT) ou fotodiodo de avalanche , transformando o sinal de luz em elétrico.

Como apenas um ponto da amostra é iluminado por vez, a imagem 2D ou 3D requer a varredura sobre um raster regular (ou seja, um padrão retangular de linhas de varredura paralelas) na amostra. O feixe é varrido através da amostra no plano horizontal usando um ou mais espelhos oscilantes ( servo controlados). Este método de varredura geralmente tem uma latência de reação baixa e a velocidade de varredura pode ser variada. Varreduras mais lentas fornecem uma melhor relação sinal-ruído , resultando em melhor contraste .

A espessura alcançável do plano focal é definida principalmente pelo comprimento de onda da luz usada dividido pela abertura numérica da lente objetiva , mas também pelas propriedades ópticas do espécime. O fino corte óptico possível torna esses tipos de microscópios particularmente bons em imagens 3D e perfis de superfície de amostras.

Fatias sucessivas formam um 'z-stack', que pode ser processado para criar uma imagem 3D, ou é mesclado em uma pilha 2D (predominantemente a intensidade máxima de pixel é tomada, outros métodos comuns incluem o uso do desvio padrão ou somar o píxeis).

A microscopia confocal fornece a capacidade de corte ótico serial direto, não invasivo, de espécimes vivos intactos, espessos, com um mínimo de preparação de amostra, bem como uma melhoria marginal na resolução lateral em comparação com a microscopia de campo amplo. As amostras biológicas são frequentemente tratadas com tintas fluorescentes para tornar visíveis os objetos selecionados. No entanto, a concentração real do corante pode ser baixa para minimizar a perturbação dos sistemas biológicos: alguns instrumentos podem rastrear moléculas fluorescentes individuais. Além disso, as técnicas transgênicas podem criar organismos que produzem suas próprias moléculas quiméricas fluorescentes (como uma fusão de GFP, proteína fluorescente verde com a proteína de interesse). Os microscópios confocais funcionam com base no princípio da excitação pontual na amostra (ponto limitado por difração) e na detecção pontual do sinal fluorescente resultante. Um orifício no detector fornece uma barreira física que bloqueia a fluorescência fora de foco. Apenas o foco, ou ponto central do disco de Airy , é registrado.

Técnicas usadas para varredura horizontal

Esta projeção de múltiplas imagens confocais, tiradas na instalação de microscopia de luz EMBL , mostra um grupo de diatomáceas com paredes celulares ciano, cloroplastos vermelhos, DNA azul e membranas e organelas verdes

Quatro tipos de microscópios confocais estão disponíveis comercialmente:

Os microscópios confocais de varredura a laser usam vários espelhos (normalmente 2 ou 3 varreduras linearmente ao longo dos eixos xey) para fazer a varredura do laser na amostra e "descan" a imagem através de um orifício fixo e detector. Esse processo geralmente é lento e não funciona para imagens ao vivo, mas pode ser útil para criar imagens representativas de alta resolução de amostras fixas .

Os microscópios confocais de disco giratório ( disco de Nipkow ) usam uma série de orifícios em movimento em um disco para escanear pontos de luz. Como uma série de furos escaneia uma área em paralelo, cada furo de alfinete pode pairar sobre uma área específica por um longo período de tempo, reduzindo assim a energia de excitação necessária para iluminar uma amostra em comparação com microscópios de varredura a laser. A diminuição da energia de excitação reduz a fototoxicidade e o fotobranqueamento de uma amostra, muitas vezes tornando-a o sistema preferido para a geração de imagens de células ou organismos vivos.

Microlentes aprimorados ou microscópios confocais de disco giratório duplo funcionam sob os mesmos princípios que microscópios confocais de disco giratório, exceto um segundo disco giratório contendo microlentes é colocado antes do disco giratório contendo os orifícios. Cada furo de alfinete tem uma microlente associada. As microlentes atuam para capturar uma ampla faixa de luz e focalizá-la em cada orifício, aumentando significativamente a quantidade de luz direcionada a cada orifício e reduzindo a quantidade de luz bloqueada pelo disco giratório. Microscópios confocais aprimorados por microlente são, portanto, significativamente mais sensíveis do que os sistemas de disco giratório padrão. A Yokogawa Electric inventou essa tecnologia em 1992.

Os microscópios de matriz programável (PAM) usam um modulador de luz espacial controlado eletronicamente (SLM) que produz um conjunto de orifícios em movimento. O SLM é um dispositivo que contém uma matriz de pixels com alguma propriedade ( opacidade , refletividade ou rotação óptica ) dos pixels individuais que podem ser ajustados eletronicamente. O SLM contém espelhos microeletromecânicos ou componentes de cristal líquido . A imagem é geralmente adquirida por uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD).

Cada uma dessas classes de microscópio confocal tem vantagens e desvantagens particulares. A maioria dos sistemas é otimizada para velocidade de gravação (ou seja, captura de vídeo) ou alta resolução espacial. Os microscópios confocais de varredura a laser podem ter uma densidade de amostragem programável e resoluções muito altas, enquanto o Nipkow e o PAM usam uma densidade de amostragem fixa definida pela resolução da câmera. As taxas de quadros de imagem são normalmente mais lentas para sistemas de varredura a laser de ponto único do que sistemas de disco giratório ou PAM. Microscópios confocais de disco giratório comerciais atingem taxas de quadros de mais de 50 por segundo - um recurso desejável para observações dinâmicas, como imagens de células vivas.

Na prática, o Nipkow e o PAM permitem que vários furos escaneiem a mesma área em paralelo, desde que os furos estejam suficientemente afastados.

O desenvolvimento de ponta de microscopia confocal de varredura a laser agora permite imagens com taxa de vídeo superior (60 quadros por segundo) usando vários espelhos de varredura microeletromecânicos.

A imagem confocal de fluorescência de raios-X é uma técnica mais recente que permite o controle da profundidade, além do direcionamento horizontal e vertical, por exemplo, ao analisar camadas enterradas em uma pintura.

Melhoria de resolução

CLSM é uma técnica de varredura em que a resolução obtida é melhor explicada comparando-a com outra técnica de varredura, como a do microscópio eletrônico de varredura (MEV). O CLSM tem a vantagem de não exigir que uma sonda fique suspensa a nanômetros da superfície, como em um AFM ou STM , por exemplo, onde a imagem é obtida por varredura com uma ponta fina sobre uma superfície. A distância da lente objetiva à superfície (chamada de distância de trabalho ) é normalmente comparável à de um microscópio óptico convencional. Isso varia com o design óptico do sistema, mas distâncias de trabalho de centenas de micrômetros a vários milímetros são típicas.

No CLSM, um espécime é iluminado por uma fonte pontual de laser e cada elemento de volume é associado a uma dispersão discreta ou intensidade de fluorescência. Aqui, o tamanho do volume de varredura é determinado pelo tamanho do ponto (próximo ao limite de difração ) do sistema óptico porque a imagem do laser de varredura não é um ponto infinitamente pequeno, mas um padrão de difração tridimensional. O tamanho deste padrão de difração e o volume focal que ele define são controlados pela abertura numérica da lente objetiva do sistema e o comprimento de onda do laser usado. Isso pode ser visto como o limite de resolução clássico de microscópios ópticos convencionais usando iluminação de campo amplo. No entanto, com a microscopia confocal é ainda possível melhorar o limite de resolução das técnicas de iluminação de campo amplo porque a abertura confocal pode ser fechada para eliminar ordens superiores do padrão de difração. Por exemplo, se o diâmetro do orifício for definido como 1 unidade Airy, então apenas a primeira ordem do padrão de difração passa pela abertura para o detector, enquanto as ordens superiores são bloqueadas, melhorando assim a resolução ao custo de uma ligeira diminuição no brilho. Em observações de fluorescência, o limite de resolução da microscopia confocal é frequentemente limitado pela relação sinal / ruído causada pelo pequeno número de fótons normalmente disponíveis na microscopia de fluorescência. Pode-se compensar esse efeito usando fotodetectores mais sensíveis ou aumentando a intensidade da fonte pontual de iluminação do laser. Aumentar a intensidade do laser de iluminação traz o risco de branqueamento excessivo ou outros danos ao espécime de interesse, especialmente para experimentos nos quais a comparação do brilho da fluorescência é necessária. Ao obter imagens de tecidos que são diferencialmente refrativos, como o mesofilo esponjoso das folhas das plantas ou outros tecidos contendo espaço aéreo, as aberrações esféricas que prejudicam a qualidade da imagem confocal são frequentemente pronunciadas. Essas aberrações, no entanto, podem ser significativamente reduzidas pela montagem de amostras em perfluorocarbonos opticamente transparentes e não tóxicos, como a perfluorodecalina , que se infiltra prontamente nos tecidos e tem um índice de refração quase idêntico ao da água.

Usos

CLSM é amplamente utilizado em várias disciplinas de ciências biológicas , desde biologia celular e genética até microbiologia e biologia do desenvolvimento . Ele também é usado em óptica quântica e imagem de nano-cristal e espectroscopia.

Biologia e medicina

Exemplo de uma pilha de imagens de microscópio confocal mostrando a distribuição dos filamentos de actina em uma célula.

Clinicamente, CLSM é usado na avaliação de várias doenças oculares e é particularmente útil para imagens, análise qualitativa e quantificação de células endoteliais da córnea . É utilizado para localizar e identificar a presença de elementos fúngicos filamentosos no estroma da córnea em casos de ceratomicose , permitindo um diagnóstico rápido e, assim, instituição precoce da terapia definitiva. A pesquisa em técnicas CLSM para procedimentos endoscópicos ( endomicroscopia ) também está se mostrando promissora. Na indústria farmacêutica, foi recomendado acompanhar o processo de fabricação de formas farmacêuticas de filme fino, para controlar a qualidade e uniformidade de distribuição dos medicamentos. A microscopia confocal também é usada para estudar biofilmes - estruturas porosas complexas que são o habitat preferido dos microrganismos. Algumas das funções temporais e espaciais dos biofilmes podem ser compreendidas apenas pelo estudo de sua estrutura em micro e mesoescalas. O estudo da microescala é necessário para detectar a atividade e a organização de um único microrganismo.

Óptica e cristalografia

CLSM é usado como mecanismo de recuperação de dados em alguns sistemas de armazenamento óptico de dados 3D e ajudou a determinar a idade do papiro Magdalen .

Preservação de áudio

O sistema IRENE faz uso de microscopia confocal para varredura óptica e recuperação de áudio histórico danificado.

Variantes e melhorias

Melhorando a resolução axial

A função de propagação de pontos do orifício é um elipsóide, várias vezes mais longo do que largo. Isso limita a resolução axial do microscópio. Uma técnica para superar isso é a microscopia 4Pi, onde a luz incidente e / ou emitida pode interferir tanto acima quanto abaixo da amostra para reduzir o volume do elipsóide. Uma técnica alternativa é a microscopia teta confocal . Nesta técnica, o cone de luz iluminante e a luz detectada formam um ângulo entre si (melhores resultados quando estão perpendiculares). A interseção das funções de dispersão de dois pontos fornece um volume de amostra efetivo muito menor. A partir disso, evoluiu o microscópio de iluminação de plano único . Além disso, a deconvolução pode ser empregada usando uma função de propagação de ponto derivada experimentalmente para remover a luz fora de foco, melhorando o contraste em ambos os planos axial e lateral.

Super resolução

Existem variantes confocais que alcançam resolução abaixo do limite de difração, como microscopia de depleção de emissão estimulada (STED). Além dessa técnica, uma ampla variedade de outras técnicas de super-resolução (não baseadas em confocal) estão disponíveis como PALM, (d) STORM, SIM e assim por diante. Todos eles têm suas próprias vantagens, como facilidade de uso, resolução e a necessidade de equipamentos especiais, tampões ou fluoróforos.

Operabilidade em baixa temperatura

Para obter imagens de amostras em baixas temperaturas, duas abordagens principais têm sido utilizadas, ambas baseadas na arquitetura de microscopia confocal de varredura a laser . Uma abordagem é usar um criostato de fluxo contínuo : apenas a amostra está em baixa temperatura e é opticamente endereçada através de uma janela transparente. Outra abordagem possível é ter parte da ótica (especialmente a objetiva do microscópio) em um dewar de armazenamento criogênico . Esta segunda abordagem, embora mais complicada, garante melhor estabilidade mecânica e evita as perdas devido à janela.

Imagens

  • Perfil de superfície parcial de uma moeda de 1 euro, medido com um microscópio confocal de disco Nipkow.

  • Dados de reflexão para moeda de 1 euro.

  • Imagem codificada por cores dos filamentos de actina em uma célula cancerosa .

  • Sinal verde do anticorpo antitubulina conjugado com Alexa Fluor 488) e núcleos (sinal azul do DNA corado com DAPI) em células do meristema da raiz Arabidopsis thaliana de 4 dias de idade (Col-0). Barra de escala: 5 um.

História

Os primórdios: 1940-1957

Esquema do pedido de patente de Minsky mostrando o princípio do microscópio de varredura confocal de transmissão que ele construiu.

Em 1940, Hans Goldmann, oftalmologista em Berna , Suíça, desenvolveu um sistema de lâmpada de fenda para documentar exames oftalmológicos. Este sistema é considerado por alguns autores posteriores como o primeiro sistema óptico confocal.

Em 1943, Zyun Koana publicou um sistema confocal. Uma figura nesta publicação mostra um caminho de feixe de transmissão confocal.

Em 1951, Hiroto Naora, um colega de Koana, descreveu um microscópio confocal na revista Science para espectrofotometria .

O primeiro microscópio de varredura confocal foi construído por Marvin Minsky em 1955 e uma patente foi registrada em 1957. A varredura do ponto de iluminação no plano focal foi realizada movendo o palco. Nenhuma publicação científica foi submetida e nenhuma imagem feita com ela foi preservada.

Microscópio de Varredura Tandem

Esquema do Microscópio de Varredura Tandem de Petráň. Barra vermelha adicionada para indicar o Nipkow-Disk.

Na década de 1960, o tchecoslovaco Mojmír Petráň da Faculdade de Medicina da Charles University em Plzeň desenvolveu o Tandem-Scanning-Microscope, o primeiro microscópio confocal comercializado. Foi vendido por uma pequena empresa na Tchecoslováquia e nos Estados Unidos pela Tracor-Northern (mais tarde Noran) e usou um disco Nipkow giratório para gerar múltiplos orifícios de excitação e emissão.

A patente da Checoslováquia foi depositada em 1966 por Petráň e Milan Hadravský, um colega de trabalho da Checoslováquia. Uma primeira publicação científica com dados e imagens gerados com este microscópio foi publicada na revista Science em 1967, de autoria de M. David Egger da Universidade de Yale e Petráň. Como nota de rodapé deste artigo, é mencionado que Petráň projetou o microscópio e supervisionou sua construção e que ele era, em parte, um "associado de pesquisa" em Yale. Uma segunda publicação de 1968 descreveu a teoria e os detalhes técnicos do instrumento e teve Hadravský e Robert Galambos , o chefe do grupo em Yale, como autores adicionais. Em 1970, a patente dos Estados Unidos foi concedida. Foi arquivado em 1967.

1969: O primeiro microscópio confocal de varredura a laser

Em 1969 e 1971, M. David Egger e Paul Davidovits da Yale University publicaram dois artigos descrevendo o primeiro microscópio confocal de varredura a laser . Era um scanner de ponto, o que significa que apenas um ponto de iluminação foi gerado. Usou microscopia de reflexão de epi-iluminação para a observação do tecido nervoso. Um laser de néon-hélio de 5 mW com luz de 633 nm foi refletido por um espelho semitransparente em direção à objetiva. O objetivo era uma lente simples com uma distância focal de 8,5 mm. Ao contrário de todos os sistemas anteriores e posteriores, a amostra foi digitalizada pelo movimento desta lente (varredura objetiva), levando a um movimento do ponto focal. A luz refletida voltou ao espelho semitransparente, a parte transmitida foi focada por outra lente no orifício de detecção atrás do qual um tubo fotomultiplicador foi colocado. O sinal foi visualizado por um CRT de um osciloscópio, o raio catódico foi movido simultaneamente com a objetiva. Um dispositivo especial permitiu fazer fotos Polaroid , três das quais foram mostradas na publicação de 1971.

Os autores especulam sobre corantes fluorescentes para investigações in vivo . Eles citam a patente de Minsky, graças a Steve Baer, ​​na época um estudante de doutorado na Escola de Medicina Albert Einstein em Nova York, onde desenvolveu um microscópio de varredura confocal de linha, por sugerir o uso de um laser com 'microscópio de Minsky' e agradecer a Galambos, Hadravsky e Petráň pelas discussões que levaram ao desenvolvimento de seu microscópio. A motivação para o seu desenvolvimento foi que, no microscópio de varredura em série, apenas uma fração de 10-7 da luz de iluminação participa da geração da imagem na ocular. Portanto, a qualidade da imagem não era suficiente para a maioria das investigações biológicas.

1977–1985: Scanners de ponto com lasers e digitalização de palco

Em 1977, Colin JR Sheppard e Amarjyoti Choudhury , Oxford , Reino Unido, publicaram uma análise teórica de microscópios confocais e de varredura a laser. É provavelmente a primeira publicação usando o termo "microscópio confocal".

Em 1978, os irmãos Christoph Cremer e Thomas Cremer publicaram um projeto para um microscópio confocal de varredura a laser usando excitação fluorescente com foco automático eletrônico. Eles também sugeriram uma iluminação de ponto de laser usando um “ holograma de ponto 4π ”. Este projeto CLSM combinou o método de varredura a laser com a detecção 3D de objetos biológicos marcados com marcadores fluorescentes pela primeira vez.

Em 1978 e 1980, o grupo Oxford em torno de Colin Sheppard e Tony Wilson descreveu um microscópio confocal com iluminação epi-laser, escaneamento de palco e tubos fotomultiplicadores como detectores. O estágio pode se mover ao longo do eixo óptico (eixo z), permitindo seções seriais ópticas.

Em 1979, Fred Brakenhoff e colegas de trabalho demonstraram que as vantagens teóricas do corte óptico e da melhoria da resolução são de fato alcançáveis ​​na prática. Em 1985, esse grupo foi o primeiro a publicar imagens convincentes tiradas em um microscópio confocal que eram capazes de responder a questões biológicas. Pouco depois, muitos outros grupos começaram a usar a microscopia confocal para responder a questões científicas que até então permaneceram um mistério devido às limitações tecnológicas.

Em 1983, IJ Cox e C. Sheppard de Oxford publicaram o primeiro trabalho em que um microscópio confocal foi controlado por um computador. O primeiro microscópio de varredura a laser comercial, o scanner de estágio SOM-25, foi oferecido pela Oxford Optoelectronics (após várias aquisições adquiridas pela BioRad) a partir de 1982. Ele foi baseado no projeto do grupo Oxford.

A partir de 1985: scanners de ponto a laser com varredura de feixe

Em meados da década de 1980, William Bradshaw Amos e John Graham White e colegas que trabalhavam no Laboratório de Biologia Molecular em Cambridge construíram o primeiro microscópio de varredura de feixe confocal. O palco com a amostra não estava se movendo, ao invés do ponto de iluminação estava, permitindo uma aquisição de imagem mais rápida: quatro imagens por segundo com 512 linhas cada. Imagens intermediárias bastante ampliadas, devido a um caminho de feixe de 1-2 metros de comprimento, permitiram o uso de um diafragma de íris convencional como um 'orifício', com diâmetros de ~ 1 mm. As primeiras micrografias foram tiradas com exposição de longo prazo em filme antes de uma câmera digital ser adicionada. Uma melhoria adicional permitiu ampliar a preparação pela primeira vez. Zeiss , Leitz e Cambridge Instruments não tinham interesse em uma produção comercial. O Medical Research Council (MRC) finalmente patrocinou o desenvolvimento de um protótipo. O projeto foi adquirido pela Bio-Rad , alterado com controle de computador e comercializado como 'MRC 500'. O sucessor MRC 600 foi mais tarde a base para o desenvolvimento do primeiro microscópio fluorescente de dois fótons desenvolvido em 1990 na Universidade Cornell .

Os desenvolvimentos no KTH Royal Institute of Technology em Estocolmo na mesma época levaram a um CLSM comercial distribuído pela empresa sueca Sarastro. O empreendimento foi adquirido em 1990 pela Molecular Dynamics, mas o CLSM acabou sendo descontinuado. Na Alemanha, a Heidelberg Instruments , fundada em 1984, desenvolveu um CLSM, que inicialmente se destinava a aplicações industriais em vez de biologia. Este instrumento foi adquirido em 1990 pela Leica Lasertechnik . A Zeiss já tinha um microscópio de varredura a laser não confocal de ponto voador no mercado, que foi atualizado para um confocal. Um relatório de 1990 mencionou alguns fabricantes de confocais: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern e Zeiss.

Em 1989, Fritz Karl Preikschat , com o filho Ekhard Preikschat, inventou o microscópio de diodo a laser para análise de tamanho de partícula. Ele e Ekhard Preikschat co-fundaram a Lasentec para comercializá-la. Em 2001, a Lasentec foi adquirida pela Mettler Toledo . Eles são usados ​​principalmente na indústria farmacêutica para fornecer controle in-situ do processo de cristalização em grandes sistemas de purificação.

Veja também

  • Microscopia de excitação de dois fótons : embora usem uma tecnologia relacionada (ambos são microscópios de varredura a laser), os microscópios de fluorescência multifóton não são microscópios estritamente confocais. O termo confocal surge da presença de um diafragma no plano focal conjugado (confocal). Este diafragma geralmente está ausente em microscópios multifotônicos.

Referências

links externos

Recursos de biblioteca sobre
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