Proteína fluorescente verde - Green fluorescent protein

Proteína fluorescente verde
PDB 1ema EBI.jpg
Estrutura da proteína fluorescente verde Aequorea victoria .
Identificadores
Símbolo GFP
Pfam PF01353
Clã Pfam CL0069
InterPro IPR011584
CATH 1ema
SCOP2 1ema / SCOPe / SUPFAM
Proteína fluorescente verde
Identificadores
Organismo Aequorea victoria
Símbolo GFP
UniProt P42212

A proteína fluorescente verde ( GFP ) é uma proteína que exibe fluorescência verde brilhante quando exposta à luz na faixa do azul ao ultravioleta . O rótulo GFP tradicionalmente se refere à proteína isolada pela primeira vez da água - viva Aequorea victoria e às vezes é chamada de avGFP . No entanto, GFPs foram encontrados em outros organismos, incluindo corais , anêmonas do mar , zoanitídeos , copépodes e lanceletes .

O GFP de A. victoria tem um pico de excitação principal em um comprimento de onda de 395 nm e um menor em 475 nm. Seu pico de emissão está em 509 nm, que está na parte verde inferior do espectro visível . O rendimento quântico de fluorescência (QY) de GFP é 0,79. O GFP do amor-perfeito do mar ( Renilla reniformis ) tem um único pico de excitação principal em 498 nm. O GFP é uma ferramenta excelente em muitas formas de biologia devido à sua capacidade de formar um cromóforo interno sem a necessidade de cofatores acessórios , produtos gênicos ou enzimas / substratos além do oxigênio molecular.

Na biologia celular e molecular , o gene GFP é freqüentemente usado como um repórter de expressão . Tem sido usado em formas modificadas para fazer biossensores , e muitos animais foram criados que expressam GFP, o que demonstra uma prova de conceito de que um gene pode ser expresso em um determinado organismo, em órgãos selecionados ou em células de interesse. A GFP pode ser introduzida em animais ou outras espécies por meio de técnicas transgênicas e mantida em seu genoma e no de sua prole. Até o momento, a GFP foi expressa em muitas espécies, incluindo bactérias, leveduras, fungos, peixes e mamíferos, inclusive em células humanas. Os cientistas Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura e Martin Chalfie receberam o Prêmio Nobel de Química de 2008 em 10 de outubro de 2008 por sua descoberta e desenvolvimento da proteína fluorescente verde.

A maioria dos genes disponíveis comercialmente para GFP e proteínas fluorescentes semelhantes têm cerca de 730 pares de bases de comprimento. A proteína natural possui 238 aminoácidos. Sua massa molecular é de 27 kD. Portanto, a fusão do gene GFP com o gene de uma proteína de interesse pode aumentar significativamente o tamanho e a massa molecular da proteína e pode prejudicar a função natural da proteína ou alterar sua localização ou trajetória de transporte dentro da célula.

Fundo

Aequorea victoria
Reconstrução 3D da imagem confocal de progenitores neurais com superexpressão de VEGF (vermelho) e células progenitoras neurais de controle positivas para GFP (verde) no bulbo olfatório de rato. Vasos sanguíneos RECA-1-positivos - cor azul.

GFP de tipo selvagem (wtGFP)

Nas décadas de 1960 e 1970, a GFP, junto com a proteína luminescente separada aequorina (uma enzima que catalisa a quebra da luciferina , liberando luz), foi purificada pela primeira vez da água-viva Aequorea victoria e suas propriedades estudadas por Osamu Shimomura . Em A. victoria , a fluorescência GFP ocorre quando aequorina interage com os íons Ca 2+ , induzindo um brilho azul. Parte dessa energia luminescente é transferida para o GFP, mudando a cor geral para o verde. No entanto, sua utilidade como ferramenta para biólogos moleculares não começou a ser percebida até 1992, quando Douglas Prasher relatou a clonagem e a sequência de nucleotídeos de wtGFP no Gene . O financiamento para este projeto havia acabado, então Prasher enviou amostras de cDNA para vários laboratórios. O laboratório de Martin Chalfie expressou a sequência de codificação de wtGFP, com os primeiros poucos aminoácidos deletados, em células heterólogas de E. coli e C. elegans , publicando os resultados na Science em 1994. O laboratório de Frederick Tsuji relatou independentemente a expressão do recombinante proteína um mês depois. Notavelmente, a molécula de GFP se dobrou e ficou fluorescente em temperatura ambiente, sem a necessidade de cofatores exógenos específicos para a água-viva. Embora este quase-wtGFP fosse fluorescente, ele tinha várias desvantagens, incluindo espectros de excitação de pico duplo, sensibilidade de pH, sensibilidade de cloreto, rendimento quântico de fluorescência pobre, fotoestabilidade pobre e dobramento deficiente a 37 ° C.

A primeira estrutura cristalina relatada de um GFP foi a do mutante S65T pelo grupo Remington na Science em 1996. Um mês depois, o grupo Phillips relatou independentemente a estrutura GFP de tipo selvagem na Nature Biotechnology . Essas estruturas cristalinas forneceram informações vitais sobre a formação de cromóforos e as interações de resíduos vizinhos. Os pesquisadores modificaram esses resíduos por mutagênese direcionada e aleatória para produzir uma grande variedade de derivados de GFP em uso hoje. Pesquisas adicionais sobre a GFP mostraram que ela é resistente a detergentes, proteases, tratamentos com cloreto de guanidínio (GdmCl) e mudanças drásticas de temperatura.

Derivados de GFP

A diversidade de mutações genéticas é ilustrada por esta cena de praia de San Diego desenhada com bactérias vivas expressando 8 cores diferentes de proteínas fluorescentes (derivadas de GFP e dsRed).

Devido ao potencial de uso difundido e às necessidades em evolução dos pesquisadores, muitos mutantes diferentes de GFP foram projetados. A primeira grande melhoria foi uma mutação de ponto único (S65T) relatada em 1995 na Nature por Roger Tsien . Esta mutação melhorou dramaticamente as características espectrais de GFP, resultando em fluorescência aumentada, fotoestabilidade e uma mudança do pico de excitação principal para 488 nm, com a emissão de pico mantida em 509 nm. Isso combinou com as características espectrais dos conjuntos de filtros FITC comumente disponíveis , aumentando a praticidade de uso pelo pesquisador geral. Um mutante pontual de eficiência de dobramento de 37 ° C (F64L) para este arcabouço, produzindo GFP aprimorado ( EGFP ), foi descoberto em 1995 pelos laboratórios de Thastrup e Falkow. EGFP permitiu o uso prático de GFPs em células de mamíferos. EGFP tem um coeficiente de extinção (denotado ε) de 55.000 M −1 cm −1 . O rendimento quântico de fluorescência (QY) de EGFP é de 0,60. O brilho relativo, expresso como ε • QY, é 33.000 M −1 cm −1 .

Superfolder GFP ( sfGFP ), uma série de mutações que permitem que o GFP se dobre e amadureça rapidamente, mesmo quando fundido com peptídeos de dobramento insuficiente, foi relatado em 2006.

Muitas outras mutações foram feitas, incluindo mutantes coloridos; em particular, proteína fluorescente azul (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteína fluorescente ciano (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) e derivados de proteína fluorescente amarela (YFP, Citrine, Venus, YPet). Derivados do BFP (exceto mKalama1) contêm a substituição Y66H. Eles exibem uma ampla banda de absorção no ultravioleta centrado perto de 380 nanômetros e um máximo de emissão em 448 nanômetros. Foi desenvolvido um mutante de proteína fluorescente verde ( BFPms1 ) que se liga preferencialmente a Zn (II) e Cu (II) . BFPms1 tem várias mutações importantes, incluindo o cromóforo BFP (Y66H), Y145F para maior rendimento quântico, H148G para criar um buraco no barril beta e várias outras mutações que aumentam a solubilidade. A ligação de Zn (II) aumenta a intensidade de fluorescência, enquanto a ligação de Cu (II) extingue a fluorescência e muda a absorbância máxima de 379 para 444 nm. Portanto, eles podem ser usados ​​como biossensores de Zn.

Uma paleta de variantes de GFP e DsRed.

Ligação cromóforo . A mutação crítica nos derivados ciano é a substituição Y66W, que faz com que o cromóforo se forme com um componente indol em vez de fenol. Várias mutações compensatórias adicionais no barril circundante são necessárias para restaurar o brilho a este cromóforo modificado devido ao aumento do grupo indol. Em ECFP e Cerulean, a metade N-terminal da sétima fita exibe duas conformações. Essas conformações têm um conjunto complexo de interações de van der Waals com o cromóforo. As mutações Y145A e H148D em Cerulean estabilizam essas interações e permitem que o cromóforo seja mais planar, melhor compactado e menos sujeito a extinção por colisão.

A mutagênese aleatória dirigida ao local adicional em combinação com a triagem baseada no tempo de vida da fluorescência estabilizou ainda mais a sétima fita β, resultando em uma variante brilhante, mTurquoise2, com um rendimento quântico (QY) de 0,93. O comprimento de onda deslocado para o vermelho dos derivados YFP é realizado pela mutação T203Y e é devido às interações de empilhamento de elétrons π entre o resíduo de tirosina substituído e o cromóforo. Essas duas classes de variantes espectrais são frequentemente empregadas para experimentos de transferência de energia de ressonância de Förster ( FRET ). Repórteres FRET geneticamente codificados sensíveis a moléculas de sinalização celular, como cálcio ou glutamato, estado de fosforilação de proteína, complementação de proteína, dimerização de receptor e outros processos fornecem leituras ópticas altamente específicas da atividade celular em tempo real.

A mutagênese semirracional de vários resíduos levou a mutantes sensíveis ao pH conhecidos como pHluorinas e, posteriormente, pHluorinas super eclípticas. Explorando a rápida mudança no pH após a fusão da vesícula sináptica, as pHluorinas marcadas com a sinaptobrevina foram usadas para visualizar a atividade sináptica nos neurônios.

GFP sensível a redox ( roGFP ) foi projetado pela introdução de cisteínas na estrutura do barril beta. O estado redox das cisteínas determina as propriedades fluorescentes de roGFP .

Nomenclatura

A nomenclatura de GFPs modificados costuma ser confusa devido ao mapeamento sobreposto de várias versões de GFP em um único nome. Por exemplo, mGFP frequentemente se refere a um GFP com uma palmitoilação N-terminal que faz com que o GFP se ligue às membranas celulares . No entanto, o mesmo termo também é usado para se referir a GFP monomérico , que muitas vezes é alcançado pela mutação A206K de quebra de interface de dímero. A GFP de tipo selvagem tem uma tendência de dimerização fraca em concentrações acima de 5 mg / mL. mGFP também significa "GFP modificado", que foi otimizado por meio da troca de aminoácidos para expressão estável em células vegetais.

Na natureza

Lancelet (B. floridae) viva sob um microscópio fluorescente.
Lancelet ( B. floridae ) viva sob um microscópio fluorescente.
Fluorescência verde no copépodo marinho Pontella mimocerami.
Fluorescência verde no copépodo marinho Pontella mimocerami.

O propósito da bioluminescência (primária) (da ação da aequorina na luciferina) e da fluorescência (secundária) da GFP em águas-vivas é desconhecido. GFP é co-expresso com aequorina em pequenos grânulos ao redor da borda do sino da água-viva. O pico de excitação secundário (480 nm) de GFP absorve parte da emissão azul da aequorina, dando à bioluminescência uma tonalidade mais verde. O resíduo de serina 65 do cromóforo GFP é responsável pelos espectros de excitação de pico duplo de GFP de tipo selvagem. É conservado em todas as três isoformas GFP originalmente clonadas por Prasher. Quase todas as mutações desse resíduo consolidam os espectros de excitação em um único pico a 395 nm ou 480 nm. O mecanismo preciso dessa sensibilidade é complexo, mas, ao que parece, envolve a doação de um hidrogênio da serina 65 para o glutamato 222, que influencia a ionização do cromóforo. Uma vez que uma única mutação pode aumentar drasticamente o pico de excitação de 480 nm, tornando o GFP um parceiro muito mais eficiente da aequorina, A. victoria parece preferir evolutivamente o espectro de excitação de pico duplo menos eficiente. Roger Tsien especulou que a variação da pressão hidrostática com a profundidade pode afetar a capacidade da serina 65 de doar um hidrogênio ao cromóforo e mudar a proporção dos dois picos de excitação. Assim, a água-viva pode mudar a cor de sua bioluminescência com a profundidade. No entanto, um colapso na população de medusas em Friday Harbor , onde a GFP foi originalmente descoberta, dificultou um estudo mais aprofundado do papel da GFP no ambiente natural da água-viva.

A maioria das espécies de lancelet são conhecidas por produzir GFP em várias regiões do corpo. Ao contrário de A. victoria , as lanceletes não produzem sua própria luz azul e a origem de sua GFP endógena ainda é desconhecida. Alguns especulam que atrai o plâncton para a boca da lanceta, servindo como um mecanismo de caça passiva. Também pode servir como um agente fotoprotetor nas larvas, evitando danos causados ​​pela luz azul de alta intensidade, convertendo-a em luz verde de baixa intensidade. No entanto, essas teorias não foram testadas.

Proteínas semelhantes a GFP foram encontradas em várias espécies de copépodes marinhos , particularmente das famílias Pontellidae e Aetideidae . GFP isolado de Pontella mimocerami mostrou altos níveis de brilho com um rendimento quântico de 0,92, tornando-os quase duas vezes mais brilhantes do que o comumente usado EGFP isolado de A. victoria.

Outras proteínas fluorescentes

Uma prateleira de tubos de ensaio mostrando soluções brilhando em cores diferentes
Proteínas diferentes produzem cores fluorescentes diferentes quando expostas à luz ultravioleta.

Existem muitas proteínas semelhantes à GFP que, apesar de pertencerem à mesma família de proteínas da GFP, não são derivadas diretamente de Aequorea victoria . Isso inclui dsRed , eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP / IrisFP, Dendra e assim por diante. Tendo sido desenvolvidas a partir de proteínas em diferentes organismos, essas proteínas podem, às vezes, exibir abordagens não antecipadas para a formação de cromóforos. Alguns deles, como KFP, são desenvolvidos a partir de proteínas naturalmente não fluorescentes ou fracamente fluorescentes para serem melhoradas por mutagênese. Quando barris semelhantes a GFP de características de espectro diferentes são usados, o espectro de excitação de um cromóforo pode ser usado para alimentar outro cromóforo (FRET), permitindo a conversão entre comprimentos de onda de luz.

As proteínas fluorescentes de ligação a FMN (FbFPs) foram desenvolvidas em 2007 e são uma classe de proteínas fluorescentes pequenas (11-16 kDa), independentes de oxigênio, derivadas de receptores de luz azul. Destinam-se especialmente ao uso em condições anaeróbias ou hipóxicas, uma vez que a formação e ligação do cromóforo Flavin não requer oxigênio molecular, como é o caso da síntese do cromóforo GFP.

Imagem de luz branca, ou imagem vista a olho nu, de proteínas fluorescentes na imagem acima.

Proteínas fluorescentes com outros cromóforos, como UnaG com bilirrubina, podem exibir propriedades únicas, como emissão com desvio para o vermelho acima de 600 nm ou fotoconversão de um estado de emissão de verde para um estado de emissão de vermelho. Eles podem ter comprimentos de onda de excitação e emissão distantes o suficiente para alcançar a conversão entre luz vermelha e verde.

Uma nova classe de proteína fluorescente foi desenvolvida a partir de uma ficobiliproteína cianobacteriana ( Trichodesmium erythraeum ) , α- aloficocianina , e denominada pequena proteína fluorescente ultra vermelha ( smURFP ) em 2016. smURFP autocataliticamente autoincorpora o cromóforo biliverdina sem a necessidade de uma proteína externa , conhecido como liase . Água - viva - e proteínas semelhantes a GFP derivadas de corais requerem oxigênio e produzem uma quantidade estequiométrica de peróxido de hidrogênio na formação do cromóforo . smURFP não requer oxigênio nem produz peróxido de hidrogênio e usa o cromóforo , biliverdina . smURFP tem um grande coeficiente de extinção (180.000 M −1 cm −1 ) e tem um rendimento quântico modesto (0,20), o que o torna um brilho biofísico comparável ao eGFP e ~ 2 vezes mais brilhante do que a maioria das proteínas fluorescentes vermelhas ou vermelhas derivadas de coral . As propriedades espectrais de smURFP são semelhantes ao corante orgânico Cy5 .

Colônias de E. coli expressando proteínas fluorescentes.

Avaliações sobre novas classes de proteínas fluorescentes e aplicações podem ser encontradas nas avaliações citadas.

Estrutura

Modelo para a formação espontânea do fluoróforo HBI (destacado em verde) em wtGFP.

O GFP tem uma estrutura de barril beta que consiste em onze fitas β com um arranjo de folha pregueada, com uma hélice alfa contendo o cromóforo ligado covalentemente 4- ( p- hidroxibenzilideno) imidazolidin-5-ona (HBI) passando pelo centro. Cinco hélices alfa mais curtas formam tampas nas extremidades da estrutura. A estrutura do barril beta é um cilindro quase perfeito, 42Å de comprimento e 24Å de diâmetro (alguns estudos relataram um diâmetro de 30Å), criando o que é referido como uma formação "β-can", que é exclusiva da família GFP-like . HBI, a forma espontaneamente modificada do tripeptídeo Ser65 – Tyr66 – Gly67, é não fluorescente na ausência do andaime GFP devidamente dobrado e existe principalmente na forma de fenol não ionizado em wtGFP. As cadeias laterais voltadas para dentro do cilindro induzem reações de ciclização específicas em Ser65 – Tyr66 – Gly67 que induzem a ionização de HBI para a forma de fenolato e formação de cromóforo . Este processo de modificação pós-tradução é conhecido como maturação . A rede de ligações de hidrogênio e as interações de empilhamento de elétrons com essas cadeias laterais influenciam a cor, intensidade e fotoestabilidade de GFP e seus numerosos derivados. A natureza compacta do cilindro exclui as moléculas de solvente, protegendo a fluorescência do cromóforo da extinção pela água. Além da autociclização do Ser65-Tyr66-Gly67, uma reação de 1,2-desidrogenação ocorre no resíduo Tyr66. Além dos três resíduos que formam o cromóforo, resíduos como Gln94, Arg96, His148, Thr203 e Glu222 atuam como estabilizadores. Os resíduos de Gln94, Arg96 e His148 são capazes de estabilizar por deslocamento da carga do cromóforo. Arg96 é o resíduo estabilizador mais importante devido ao fato de que ele induz os realinhamentos estruturais necessários que são necessários a partir do anel HBI para ocorrer. Qualquer mutação no resíduo Arg96 resultaria em uma diminuição na taxa de desenvolvimento do cromóforo porque as interações eletrostáticas e estéricas adequadas seriam perdidas. Tyr66 é o receptor de ligações de hidrogênio e não ioniza para produzir eletrostática favorável.

Filme GFP mostrando toda a estrutura e amplie o cromóforo fluorescente.
Moléculas de GFP desenhadas em estilo cartoon, uma completa e outra com a lateral do barril beta cortada para revelar o cromóforo (destacado como bola e palito ). Do PDB : 1GFL .
Diagrama de fita GFP. Do PDB : 1EMA .

Formulários

Ensaios de repórter

A proteína fluorescente verde pode ser usada como um gene repórter .

Por exemplo, o GFP pode ser usado como um repórter para os níveis de toxicidade ambiental. Esta proteína demonstrou ser uma forma eficaz de medir os níveis de toxicidade de vários produtos químicos, incluindo etanol, p- formaldeído, fenol, triclosan e parabeno. A GFP é ótima como uma proteína repórter porque não tem efeito no hospedeiro quando introduzida no ambiente celular do hospedeiro. Devido a essa capacidade, nenhuma mancha de visualização externa, ATP ou cofatores são necessários. No que diz respeito aos níveis de poluentes, a fluorescência foi medida para avaliar o efeito que os poluentes têm na célula hospedeira. A densidade celular da célula hospedeira também foi medida. Os resultados do estudo conduzido por Song, Kim, & Seo (2016) mostraram que houve uma diminuição na fluorescência e na densidade celular à medida que os níveis de poluentes aumentaram. Isso era indicativo do fato de que a atividade celular havia diminuído. Mais pesquisas sobre esta aplicação específica, a fim de determinar o mecanismo pelo qual GFP atua como um marcador de poluente. Resultados semelhantes foram observados em peixes-zebra porque peixes-zebra que foram injetados com GFP foram aproximadamente vinte vezes mais suscetíveis a reconhecer tensões celulares do que peixes-zebra que não foram injetados com GFP.

Vantagens

A maior vantagem do GFP é que ele pode ser hereditário, dependendo de como foi introduzido, permitindo o estudo contínuo das células e tecidos nos quais é expresso. Visualizar o GFP não é invasivo, exigindo apenas iluminação com luz azul. GFP por si só não interfere com os processos biológicos, mas quando fundido com proteínas de interesse, o projeto cuidadoso de ligantes é necessário para manter a função da proteína de interesse. Além disso, se usado com um monômero, é capaz de se difundir facilmente através das células.

Microscópio Fluorescente

Superresolução com duas proteínas de fusão (GFP-Snf2H e RFP-H2A), estudos de co-localização (2CLM) no núcleo de uma célula de câncer ósseo. 120.000 moléculas localizadas em uma área de campo amplo (470 µm 2 ).

A disponibilidade de GFP e seus derivados redefiniu completamente a microscopia de fluorescência e a forma como ela é usada em biologia celular e outras disciplinas biológicas. Enquanto a maioria das pequenas moléculas fluorescentes como FITC (isotiocianato de fluoresceína) são fortemente fototóxicas quando usadas em células vivas, proteínas fluorescentes como GFP são geralmente muito menos prejudiciais quando iluminadas em células vivas. Isso desencadeou o desenvolvimento de sistemas de microscopia de fluorescência de células vivas altamente automatizados, que podem ser usados ​​para observar células expressando ao longo do tempo uma ou mais proteínas marcadas com proteínas fluorescentes.

Existem muitas técnicas para utilizar GFP em um experimento de imagem de células vivas. A maneira mais direta de utilizar o GFP é anexá-lo diretamente a uma proteína de interesse. Por exemplo, o GFP pode ser incluído em um plasmídeo que expressa outros genes para indicar uma transfecção bem-sucedida de um gene de interesse. Outro método é usar um GFP que contém uma mutação em que a fluorescência muda de verde para amarelo ao longo do tempo, o que é conhecido como um temporizador fluorescente. Com o cronômetro fluorescente, os pesquisadores podem estudar o estado da produção de proteína, como recentemente ativada, continuamente ativada ou recentemente desativada com base na cor relatada pela proteína fluorescente. Em outro exemplo, o cientista modificou o GFP para se tornar ativo apenas após a exposição à irradiação, dando aos pesquisadores uma ferramenta para ativar seletivamente certas porções de uma célula e observar onde as proteínas marcadas com o GFP se movem a partir do local inicial. Estes são apenas dois exemplos em um campo florescente de microcopia fluorescente e uma revisão mais completa de biossensores utilizando GFP e outras proteínas fluorescentes pode ser encontrada aqui

Por exemplo, GFP tem sido amplamente utilizado na marcação de espermatozóides de vários organismos para fins de identificação como em Drosophila melanogaster , onde a expressão de GFP pode ser usada como um marcador para uma característica particular. GFP também pode ser expresso em diferentes estruturas, permitindo a distinção morfológica. Nesses casos, o gene para a produção de GFP é incorporado ao genoma do organismo na região do DNA que codifica as proteínas-alvo e que é controlada pela mesma sequência regulatória ; ou seja, a sequência reguladora do gene agora controla a produção de GFP, além da (s) proteína (s) marcada (s). Em células onde o gene é expresso e as proteínas marcadas são produzidas, o GFP é produzido ao mesmo tempo. Assim, apenas aquelas células nas quais o gene marcado é expresso, ou as proteínas alvo são produzidas, irão apresentar fluorescência quando observadas sob microscopia de fluorescência. A análise de tais filmes de lapso de tempo redefiniu a compreensão de muitos processos biológicos, incluindo enovelamento de proteínas, transporte de proteínas e dinâmica de RNA, que no passado eram estudados usando material fixo (isto é, morto). Os dados obtidos também são usados ​​para calibrar modelos matemáticos de sistemas intracelulares e para estimar taxas de expressão gênica. Da mesma forma, GFP pode ser usado como um indicador da expressão de proteínas em sistemas heterólogos. Nesse cenário, proteínas de fusão contendo GFP são introduzidas indiretamente, usando o RNA do construto, ou diretamente, com a própria proteína marcada. Este método é útil para estudar as características estruturais e funcionais da proteína marcada em uma escala macromolecular ou de molécula única com microscopia de fluorescência.

O microscópio Vertico SMI usando a tecnologia SPDM Phymod usa o chamado efeito de "fotobranqueamento reversível" de corantes fluorescentes como GFP e seus derivados para localizá-los como moléculas únicas em uma resolução óptica de 10 nm. Isso também pode ser realizado como uma co-localização de dois derivados de GFP (2CLM).

Outro uso poderoso da GFP é expressar a proteína em pequenos conjuntos de células específicas. Isso permite que os pesquisadores detectem opticamente tipos específicos de células in vitro (em um prato), ou mesmo in vivo (no organismo vivo). Combinar geneticamente várias variantes espectrais de GFP é um truque útil para a análise dos circuitos do cérebro ( Brainbow ). Outros usos interessantes de proteínas fluorescentes na literatura incluem o uso de FPs como sensores do potencial de membrana neuronal , rastreamento de receptores AMPA nas membranas celulares, entrada viral e infecção de vírus influenza individuais e vírus lentivirais, etc.

Também foi descoberto que novas linhagens de ratos transgênicos GFP podem ser relevantes para terapia genética, bem como medicina regenerativa. Ao usar GFP de "alta expressão", os ratos transgênicos exibem alta expressão na maioria dos tecidos e muitas células que não foram caracterizadas ou foram apenas mal caracterizadas em ratos transgênicos anteriores com GFP.

GFP demonstrou ser útil na criobiologia como um ensaio de viabilidade . A correlação de viabilidade medida por ensaios de azul de tripano foi de 0,97. Outra aplicação é o uso de co-transfecção GFP como controle interno para a eficiência de transfecção em células de mamíferos.

Um novo uso possível de GFP inclui usá-lo como um monitor sensível de processos intracelulares por meio de um sistema de laser eGFP feito de uma linha celular de rim embrionário humano. O primeiro laser vivo projetado é feito por uma célula expressando eGFP dentro de uma cavidade óptica reflexiva e atingindo-a com pulsos de luz azul. Em um determinado limite de pulso, a saída óptica do eGFP torna-se mais brilhante e completamente uniforme na cor verde puro com um comprimento de onda de 516 nm. Antes de ser emitida como luz laser, a luz salta para frente e para trás dentro da cavidade do ressonador e passa pela célula várias vezes. Ao estudar as mudanças na atividade óptica, os pesquisadores podem entender melhor os processos celulares.

O GFP é amplamente utilizado na pesquisa do câncer para rotular e rastrear células cancerígenas. As células cancerosas marcadas com GFP têm sido usadas para modelar a metástase, o processo pelo qual as células cancerosas se espalham para órgãos distantes.

Dividir GFP

GFP pode ser usado para analisar a co-localização de proteínas. Isso é conseguido ao "dividir" a proteína em dois fragmentos que são capazes de se automontar e, em seguida, fundir cada um deles às duas proteínas de interesse. Sozinhos, esses fragmentos incompletos de GFP são incapazes de fluorescência. No entanto, se as duas proteínas de interesse colocalizam, então os dois fragmentos de GFP se montam para formar uma estrutura semelhante a GFP que é capaz de apresentar fluorescência. Portanto, medindo o nível de fluorescência, é possível determinar se as duas proteínas de interesse se colocalizam.

Macrofotografia

Processos biológicos em macroescala, como a propagação de infecções de vírus, podem ser seguidos usando a rotulagem GFP. No passado, a luz ultravioleta mutagênica (UV) foi usada para iluminar organismos vivos (por exemplo, consulte) para detectar e fotografar a expressão de GFP. Recentemente, uma técnica usando luzes LED não mutagênicas foi desenvolvida para macrofotografia. A técnica utiliza um acessório de câmera de epifluorescência baseado no mesmo princípio usado na construção de microscópios de epifluorescência .

Animais de estimação transgênicos

Camundongos expressando GFP sob luz ultravioleta (esquerda e direita), em comparação com o mouse normal (centro)

Alba , um coelho verde-fluorescente, foi criado por um laboratório francês encomendado por Eduardo Kac usando GFP para fins de arte e comentário social. A empresa norte-americana Yorktown Technologies vende para aquários peixes-zebra fluorescentes verdes ( GloFish ) que foram inicialmente desenvolvidos para detectar poluição em cursos d' água. NeonPets, uma empresa com sede nos Estados Unidos, comercializou ratos verdes fluorescentes para a indústria de animais de estimação como NeonMice. Porcos verdes fluorescentes, conhecidos como Noels, foram criados por um grupo de pesquisadores liderados por Wu Shinn-Chih no Departamento de Ciência Animal e Tecnologia da Universidade Nacional de Taiwan . Uma equipe nipo-americana criou gatos com fluorescência verde como prova de conceito para usá-los potencialmente como organismos modelo para doenças, particularmente o HIV . Em 2009, uma equipe sul-coreana da Universidade Nacional de Seul criou os primeiros beagles transgênicos com células de fibroblastos de anêmonas do mar. Os cães emitem uma luz fluorescente vermelha e têm como objetivo permitir que os cientistas estudem os genes que causam doenças humanas como a narcolepsia e a cegueira.

Arte

Julian Voss-Andreae , um artista alemão especializado em "esculturas de proteínas", criou esculturas baseadas na estrutura da GFP, incluindo a "Green Fluorescent Protein" (2004) de 1,70 m (5'6 ") de altura e 1,40 m ( 4'7 ") de altura" Steel Jellyfish "(2006). A última escultura está localizada no local da descoberta de GFP por Shimomura em 1962, a Universidade de Washington 's Harbor Laboratories sexta-feira .

A escultura de Julian Voss-Andreae baseada em GFP Steel Jellyfish (2006). A imagem mostra a escultura de aço inoxidável nos Laboratórios Friday Harbor na Ilha de San Juan (Wash., EUA), o local da descoberta do GFP.

Veja também

Referências

Leitura adicional

links externos