Entrega de genes - Gene delivery
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Entrega de genes é o processo de introdução de material genético estranho, como DNA ou RNA , nas células hospedeiras . A entrega do gene deve chegar ao genoma da célula hospedeira para induzir a expressão do gene . A entrega bem-sucedida do gene requer que a entrega do gene estranho permaneça estável dentro da célula hospedeira e possa se integrar ao genoma ou se replicar independentemente dele. Isso requer que o DNA estranho seja sintetizado como parte de um vetor , que é projetado para entrar na célula hospedeira desejada e entregar o transgene ao genoma dessa célula. Os vetores utilizados como método para entrega de genes podem ser divididos em duas categorias, vírus recombinantes e vetores sintéticos (virais e não virais).
Em eucariotos multicelulares complexos (mais especificamente Weissmanistas ), se o transgene for incorporado nas células da linha germinativa do hospedeiro , a célula hospedeira resultante pode passar o transgene para sua progênie . Se o transgene for incorporado às células somáticas , o transgene permanecerá com a linha de células somáticas e, portanto, com seu organismo hospedeiro.
A entrega de genes é uma etapa necessária na terapia gênica para a introdução ou silenciamento de um gene para promover um resultado terapêutico em pacientes e também tem aplicações na modificação genética de culturas. Existem muitos métodos diferentes de entrega de genes para vários tipos de células e tecidos.
História
Os vetores de base viral surgiram na década de 1980 como uma ferramenta para a expressão do transgene. Em 1983, Albert Siegel descreveu o uso de vetores virais na expressão de transgene de plantas, embora a manipulação viral por meio de clonagem de cDNA ainda não estivesse disponível. O primeiro vírus para ser utilizado como um vector de vacina foi a vacina do vírus em 1984, como uma maneira para proteger chimpanzés contra a hepatite B . A entrega de genes não virais foi relatada pela primeira vez em 1943 por Avery et al. que mostraram alteração do fenótipo celular por meio da exposição ao DNA exógeno .
Métodos
Existem vários métodos disponíveis para entregar genes às células hospedeiras. Quando os genes são entregues a bactérias ou plantas, o processo é chamado de transformação e quando é usado para entregar genes a animais é chamado de transfecção . Isso porque a transformação tem um significado diferente em relação aos animais, indicando a progressão para um estado canceroso. Para algumas bactérias, nenhum método externo é necessário para introduzir genes, pois eles são naturalmente capazes de absorver DNA estranho . A maioria das células requer algum tipo de intervenção para tornar a membrana celular permeável ao DNA e permitir que o DNA seja inserido de forma estável no genoma do hospedeiro .
Químico
Métodos de entrega de genes baseados em produtos químicos podem usar compostos naturais ou sintéticos para formar partículas que facilitam a transferência de genes para as células. Esses vetores sintéticos têm a capacidade de se ligar eletrostaticamente a DNA ou RNA e compactar a informação genética para acomodar transferências genéticas maiores. Os vetores químicos geralmente entram nas células por endocitose e podem proteger o material genético da degradação.
Choque térmico
Um dos métodos mais simples envolve alterar o ambiente da célula e, em seguida, estressá-lo com um choque térmico . Normalmente, as células são incubadas em uma solução contendo cátions divalentes (geralmente cloreto de cálcio ) sob condições frias, antes de serem expostas a um pulso de calor. O cloreto de cálcio rompe parcialmente a membrana celular, o que permite que o DNA recombinante entre na célula hospedeira. Sugere-se que a exposição das células a cátions divalentes em condições frias pode alterar ou enfraquecer a estrutura da superfície celular, tornando-a mais permeável ao DNA. Acredita-se que o pulso de calor crie um desequilíbrio térmico através da membrana celular, o que força o DNA a entrar nas células através dos poros celulares ou da parede celular danificada.
Fosfato de cálcio
Outro método simples envolve o uso de fosfato de cálcio para ligar o DNA e, em seguida, expô-lo a células em cultura. A solução, junto com o DNA, é encapsulada pelas células e uma pequena quantidade de DNA pode ser integrada ao genoma.
Lipossomas e polímeros
Lipossomas e polímeros podem ser usados como vetores para entregar DNA às células. Os lipossomas com carga positiva ligam-se ao DNA com carga negativa, enquanto os polímeros podem ser projetados para interagir com o DNA. Eles formam lipoplexos e poliplexos, respectivamente, que são então absorvidos pelas células. Os dois sistemas também podem ser combinados. Os vetores não virais baseados em polímeros usam polímeros para interagir com o DNA e formar poliplexos.
Nanopartículas
O uso de nanopartículas inorgânicas e orgânicas projetadas é outra abordagem não viral para a entrega de genes.
Fisica
A entrega de genes artificiais pode ser mediada por métodos físicos que usam a força para introduzir material genético através da membrana celular.
Eletroporação
A eletroporação é um método de promoção da competência . As células são brevemente chocadas com um campo elétrico de 10-20 kV / cm, que cria buracos na membrana celular através dos quais o DNA do plasmídeo pode entrar. Após o choque elétrico, os orifícios são rapidamente fechados pelos mecanismos de reparo da membrana da célula.
Biolística
Outro método usado para transformar células vegetais é a biolística , em que partículas de ouro ou tungstênio são revestidas com DNA e, em seguida, disparadas em células vegetais jovens ou embriões vegetais. Algum material genético entra nas células e as transforma. Este método pode ser usado em plantas que não são suscetíveis à infecção por Agrobacterium e também permite a transformação de plastídeos de plantas . As células das plantas também podem ser transformadas usando eletroporação, que usa um choque elétrico para tornar a membrana celular permeável ao DNA do plasmídeo. Devido aos danos causados às células e ao DNA, a eficiência de transformação da biolística e eletroporação é inferior à da transformação agrobacteriana.
Microinjeção
Microinjeção é onde o DNA é injetado através do envelope nuclear da célula diretamente no núcleo .
Sonoporação
A sonoporação usa ondas sonoras para criar poros em uma membrana celular para permitir a entrada de material genético.
Fotoporação
Fotoporação ocorre quando pulsos de laser são usados para criar poros em uma membrana celular para permitir a entrada de material genético.
Magnetofecção
A magnetofecção usa partículas magnéticas complexadas com DNA e um campo magnético externo que concentra partículas de ácido nucléico nas células-alvo.
Hidroporação
Um efeito capilar hidrodinâmico pode ser usado para manipular a permeabilidade celular.
Agrobacterium
Em plantas do ADN é muitas vezes inserida usando Agrobacterium mediada por recombinação , aproveitando a Agrobacterium s T-DNA sequência que permite a inserção natural de material genético em células de plantas. O tecido da planta é cortado em pequenos pedaços e embebido em um fluido contendo Agrobacterium suspenso . A bactéria se fixará em muitas das células vegetais expostas pelos cortes. A bactéria usa a conjugação para transferir um segmento de DNA chamado T-DNA de seu plasmídeo para a planta. O DNA transferido é pilotado para o núcleo da célula vegetal e integrado ao DNA genômico da planta hospedeira. O T-DNA plasmídeo é integrado de forma semi-aleatória no genoma da célula hospedeira.
Ao modificar o plasmídeo para expressar o gene de interesse, os pesquisadores podem inserir o gene escolhido de forma estável no genoma das plantas. As únicas partes essenciais do T-DNA são suas duas pequenas repetições de borda (25 pares de bases), pelo menos uma das quais é necessária para a transformação da planta. Os genes a serem introduzidos na planta são clonados em um vetor de transformação de planta que contém a região T-DNA do plasmídeo . Um método alternativo é a agroinfiltração .
Entrega viral
A entrega de genes mediada por vírus utiliza a capacidade de um vírus de injetar seu DNA dentro de uma célula hospedeira e aproveita a capacidade do próprio vírus de se replicar e implementar seu próprio material genético. Os métodos virais de entrega de genes têm maior probabilidade de induzir uma resposta imune, mas têm alta eficiência. A transdução é o processo que descreve a inserção de DNA mediada por vírus na célula hospedeira. Os vírus são uma forma particularmente eficaz de entrega de genes porque a estrutura do vírus evita a degradação por meio dos lisossomas do DNA que ele entrega ao núcleo da célula hospedeira. Na terapia gênica, um gene que se destina à distribuição é empacotado em uma partícula viral deficiente para replicação para formar um vetor viral . Os vírus usados para terapia genética até o momento incluem retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados e vírus herpes simplex. No entanto, existem desvantagens em usar vírus para entregar genes às células. Os vírus podem entregar apenas pedaços muito pequenos de DNA nas células, é trabalhoso e há riscos de locais de inserção aleatórios, efeitos citopáticos e mutagênese.
A entrega de genes baseada em vetor viral usa um vetor viral para entregar material genético à célula hospedeira. Isso é feito usando um vírus que contém o gene desejado e removendo a parte do genoma do vírus que é infecciosa. Os vírus são eficientes na entrega de material genético ao núcleo da célula hospedeira, que é vital para a replicação.
Vetores virais baseados em RNA
Os vírus baseados em RNA foram desenvolvidos devido à capacidade de transcrever diretamente de transcritos de RNA infecciosos. Os vetores de RNA são rapidamente expressos e expressos na forma direcionada, uma vez que nenhum processamento é necessário. A integração do gene leva à expressão do transgene de longo prazo, mas a entrega baseada em RNA é geralmente transitória e não permanente. Os vetores retrovirais incluem vírus oncoretrovirais, lentivirais e espumosos humanos .
Vetores virais baseados em DNA
Os vetores virais baseados em DNA costumam durar mais com a possibilidade de integração no genoma. Os vetores virais baseados em DNA incluem Adenoviridae , vírus adeno-associados e vírus herpes simplex .
Formulários
Terapia de genes
Vários dos métodos usados para facilitar a entrega de genes têm aplicações para fins terapêuticos. A terapia gênica utiliza a entrega de genes para entregar material genético com o objetivo de tratar uma doença ou condição na célula. A entrega de genes em ambientes terapêuticos utiliza vetores não imunogênicos capazes de especificidade celular que podem entregar uma quantidade adequada de expressão do transgene para causar o efeito desejado.
Os avanços na genômica permitiram uma variedade de novos métodos e alvos genéticos a serem identificados para possíveis aplicações. Microarranjos de DNA usados em uma variedade de nova geração-sequenciação pode identificar milhares de genes simultaneamente, com o software de análise olhando para os padrões de expressão de genes, e orthologou s genes em espécies modelo para identificar função. Isso permitiu que uma variedade de vetores possíveis fossem identificados para uso em terapia genética. Como um método para criar uma nova classe de vacina, a entrega de genes tem sido utilizada para gerar um vetor biossintético híbrido para entregar uma possível vacina. Este vetor supera as barreiras tradicionais à entrega de genes combinando E. coli com um polímero sintético para criar um vetor que mantém o DNA de plasmídeo enquanto tem uma maior capacidade de evitar a degradação por lisossomas de células alvo.
Veja também
Referências
Leitura adicional
- Segura T, Shea LD (2001). "Materiais para entrega de gene não viral". Revisão Anual de Pesquisa de Materiais . 31 : 25–46. Bibcode : 2001AnRMS..31 ... 25S . doi : 10.1146 / annurev.matsci.31.1.25 .
- Luo D, Saltzman WM (janeiro de 2000). "Synthetic DNA delivery systems". Nature Biotechnology . 18 (1): 33–7. doi : 10.1038 / 71889 . PMID 10625387 . S2CID 7068508 .