DNA recombinante - Recombinant DNA

Construção de DNA recombinante, no qual um fragmento de DNA estranho é inserido em um vetor de plasmídeo. Neste exemplo, o gene indicado pela cor branca é inativado após a inserção do fragmento de DNA estranho.

As moléculas de DNA recombinante ( rDNA ) são moléculas de DNA formadas por métodos laboratoriais de recombinação genética (como a clonagem molecular ) que reúnem material genético de fontes múltiplas, criando sequências que de outra forma não seriam encontradas no genoma .

DNA recombinante é o nome geral para um pedaço de DNA que foi criado pela combinação de pelo menos dois fragmentos de duas fontes diferentes. O DNA recombinante é possível porque as moléculas de DNA de todos os organismos compartilham a mesma estrutura química e diferem apenas na sequência de nucleotídeos dentro dessa estrutura geral idêntica. As moléculas de DNA recombinante às vezes são chamadas de DNA quimérico , porque podem ser feitas de material de duas espécies diferentes, como a quimera mítica . A tecnologia R-DNA usa sequências palindrômicas e leva à produção de pontas grudentas e cegas .

As sequências de DNA usadas na construção de moléculas de DNA recombinante podem ser originárias de qualquer espécie . Por exemplo, o DNA da planta pode ser unido ao DNA bacteriano, ou o DNA humano pode ser unido ao DNA fúngico. Além disso, as sequências de DNA que não ocorrem em qualquer lugar da natureza podem ser criadas pela síntese química de DNA e incorporadas em moléculas recombinantes. Usando tecnologia de DNA recombinante e DNA sintético, literalmente qualquer sequência de DNA pode ser criada e introduzida em qualquer um de uma ampla gama de organismos vivos.

As proteínas que podem resultar da expressão de DNA recombinante em células vivas são denominadas proteínas recombinantes . Quando o DNA recombinante que codifica uma proteína é introduzido em um organismo hospedeiro, a proteína recombinante não é necessariamente produzida. A expressão de proteínas estranhas requer o uso de vetores de expressão especializados e muitas vezes necessita de uma reestruturação significativa por sequências de codificação estranhas.

O DNA recombinante difere da recombinação genética porque o primeiro resulta de métodos artificiais no tubo de ensaio, enquanto o último é um processo biológico normal que resulta na remixagem de sequências de DNA existentes em essencialmente todos os organismos.

Criação de DNA

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A clonagem molecular é o processo de laboratório usado para criar DNA recombinante. É um dos dois métodos mais amplamente utilizados, junto com a reação em cadeia da polimerase (PCR), usada para direcionar a replicação de qualquer sequência de DNA específica escolhida pelo experimentalista. Existem duas diferenças fundamentais entre os métodos. Uma delas é que a clonagem molecular envolve a replicação do DNA dentro de uma célula viva, enquanto a PCR replica o DNA no tubo de ensaio, livre de células vivas. A outra diferença é que a clonagem envolve cortar e colar sequências de DNA, enquanto o PCR amplifica copiando uma sequência existente.

A formação de DNA recombinante requer um vetor de clonagem , uma molécula de DNA que se replica dentro de uma célula viva. Os vetores são geralmente derivados de plasmídeos ou vírus e representam segmentos relativamente pequenos de DNA que contêm sinais genéticos necessários para a replicação, bem como elementos adicionais para conveniência na inserção de DNA estranho, identificação de células que contêm DNA recombinante e, quando apropriado, expressão de DNA estranho. A escolha do vetor para clonagem molecular depende da escolha do organismo hospedeiro, do tamanho do DNA a ser clonado e se e como o DNA estranho deve ser expresso. Os segmentos de DNA podem ser combinados usando uma variedade de métodos, tais como clonagem de enzima de restrição / ligase ou montagem de Gibson .

Em protocolos de clonagem padrão, a clonagem de qualquer fragmento de DNA envolve essencialmente sete etapas: (1) Escolha do organismo hospedeiro e vetor de clonagem, (2) Preparação do DNA do vetor, (3) Preparação do DNA a ser clonado, (4) Criação de DNA recombinante, (5) Introdução de DNA recombinante no organismo hospedeiro, (6) Seleção de organismos contendo DNA recombinante, e (7) Rastreio de clones com inserções de DNA e propriedades biológicas desejadas. Essas etapas são descritas com alguns detalhes em um artigo relacionado ( clonagem molecular ).

Expressão de DNA

Após o transplante no organismo hospedeiro, o DNA estranho contido na construção de DNA recombinante pode ou não ser expresso . Ou seja, o DNA pode simplesmente ser replicado sem expressão ou pode ser transcrito e traduzido e uma proteína recombinante é produzida. De um modo geral, a expressão de um gene estranho requer a reestruturação do gene para incluir sequências que são necessárias para a produção de uma molécula de mRNA que pode ser usada pelo aparelho de tradução do hospedeiro (por exemplo , promotor , sinal de iniciação da tradução e terminador da transcrição ). Mudanças específicas no organismo hospedeiro podem ser feitas para melhorar a expressão do gene ectópico. Além disso, também podem ser necessárias alterações nas sequências de codificação, para otimizar a tradução, tornar a proteína solúvel, direcionar a proteína recombinante para a localização celular ou extracelular adequada e estabilizar a degradação da proteína.

Propriedades de organismos contendo DNA recombinante

Na maioria dos casos, os organismos contendo DNA recombinante têm fenótipos aparentemente normais . Ou seja, sua aparência, comportamento e metabolismo geralmente permanecem inalterados, e a única maneira de demonstrar a presença de sequências recombinantes é examinar o próprio DNA, normalmente usando um teste de reação em cadeia da polimerase (PCR). Exceções significativas existem e são discutidas a seguir.

Se as sequências de rDNA codificam um gene que é expresso, então a presença de RNA e / ou produtos de proteína do gene recombinante pode ser detectada, normalmente usando RT-PCR ou métodos de hibridização Western . Mudanças fenotípicas brutas não são a norma, a menos que o gene recombinante tenha sido escolhido e modificado de modo a gerar atividade biológica no organismo hospedeiro. Os fenótipos adicionais que são encontrados incluem toxicidade para o organismo hospedeiro induzida pelo produto do gene recombinante, especialmente se for superexpresso ou expresso em células ou tecidos inadequados.

Em alguns casos, o DNA recombinante pode ter efeitos deletérios, mesmo se não for expresso. Um mecanismo pelo qual isso acontece é a inativação por inserção , na qual o rDNA é inserido no gene de uma célula hospedeira. Em alguns casos, os pesquisadores usam esse fenômeno para " nocautear " genes para determinar sua função biológica e importância. Outro mecanismo pelo qual a inserção de rDNA no DNA cromossômico pode afetar a expressão gênica é pela ativação inadequada de genes de células hospedeiras anteriormente não expressos. Isso pode acontecer, por exemplo, quando um fragmento de DNA recombinante contendo um promotor ativo fica localizado próximo a um gene de célula hospedeira anteriormente silencioso, ou quando um gene de célula hospedeira que funciona para restringir a expressão gênica sofre inativação por inserção por DNA recombinante.

Aplicações de DNA

O DNA recombinante é amplamente utilizado em biotecnologia , medicina e pesquisa . Hoje, proteínas recombinantes e outros produtos que resultam do uso da tecnologia de DNA são encontrados essencialmente em todas as farmácias, consultórios médicos ou veterinários, laboratórios de testes médicos e laboratórios de pesquisa biológica ocidentais. Além disso, organismos que foram manipulados usando tecnologia de DNA recombinante, bem como produtos derivados desses organismos, encontraram seu caminho em muitas fazendas, supermercados , armários de remédios caseiros e até mesmo pet shops, como aqueles que vendem GloFish e outros geneticamente animais modificados .

A aplicação mais comum do DNA recombinante é na pesquisa básica, na qual a tecnologia é importante para a maioria dos trabalhos atuais nas ciências biológicas e biomédicas. O DNA recombinante é usado para identificar, mapear e sequenciar genes e determinar sua função. As sondas de rDNA são empregadas na análise da expressão gênica em células individuais e em todos os tecidos de organismos inteiros. As proteínas recombinantes são amplamente utilizadas como reagentes em experimentos de laboratório e para gerar sondas de anticorpos para examinar a síntese de proteínas dentro de células e organismos.

Muitas aplicações práticas adicionais do DNA recombinante são encontradas na indústria, produção de alimentos, medicina humana e veterinária, agricultura e bioengenharia. Alguns exemplos específicos são identificados a seguir.

Quimosina recombinante
Encontrada no coalho , a quimosina é uma enzima necessária para a fabricação de queijo. Foi o primeiro aditivo alimentar geneticamente modificado usado comercialmente. Tradicionalmente, os processadores obtinham a quimosina do coalho, uma preparação derivada do quarto estômago de bezerros alimentados com leite. Os cientistas desenvolveram uma cepa não patogênica (K-12) da bactéria E. coli para a produção laboratorial em grande escala da enzima. Esta enzima recombinante produzida microbiologicamente, estruturalmente idêntica à enzima derivada de bezerro, custa menos e é produzida em quantidades abundantes. Hoje, cerca de 60% do queijo duro dos EUA é feito com quimosina geneticamente modificada. Em 1990, a FDA concedeu o status de quimosina " geralmente reconhecida como segura " (GRAS) com base em dados que mostram que a enzima era segura.
Insulina humana recombinante
Substituiu quase completamente a insulina obtida de origem animal (por exemplo, porcos e gado) para o tratamento da diabetes insulino-dependente . Uma variedade de diferentes preparações de insulina recombinante são amplamente utilizadas. A insulina recombinante é sintetizada inserindo o gene da insulina humana em E. coli , ou levedura (Saccharomyces cerevisiae) que então produz insulina para uso humano.
Hormônio de crescimento humano recombinante (HGH, somatotropina)
Administrado a pacientes cujas glândulas pituitárias geram quantidades insuficientes para suportar o crescimento e desenvolvimento normais. Antes do HGH recombinante se tornar disponível, o HGH para uso terapêutico foi obtido das glândulas pituitárias de cadáveres. Essa prática insegura levou alguns pacientes a desenvolver a doença de Creutzfeldt-Jakob . O HGH recombinante eliminou esse problema e agora é usado terapeuticamente. Também tem sido usado indevidamente como uma droga para melhorar o desempenho por atletas e outros. Entrada DrugBank
Fator VIII de coagulação sanguínea recombinante
Proteína de coagulação do sangue administrada a pacientes com formas do distúrbio hemorrágico da hemofilia, que são incapazes de produzir fator VIII em quantidades suficientes para suportar a coagulação normal do sangue. Antes do desenvolvimento do fator VIII recombinante, a proteína era obtida pelo processamento de grandes quantidades de sangue humano de vários doadores, o que apresentava um risco muito alto de transmissão de doenças infecciosas transmitidas pelo sangue , por exemplo HIV e hepatite B. Entrada no DrugBank
Vacina recombinante contra hepatite B
A infecção da hepatite B é controlada através do uso de uma vacina recombinante contra a hepatite B, que contém uma forma do antígeno de superfície do vírus da hepatite B que é produzido nas células de levedura. O desenvolvimento da vacina de subunidade recombinante foi um desenvolvimento importante e necessário porque o vírus da hepatite B, ao contrário de outros vírus comuns, como o vírus da poliomielite , não pode ser cultivado in vitro . Informações sobre vacinas da Hepatitis B Foundation
Diagnóstico de infecção com HIV
Cada um dos três métodos amplamente usados ​​para diagnosticar a infecção pelo HIV foi desenvolvido usando DNA recombinante. O teste de anticorpos ( ELISA ou western blot ) usa uma proteína recombinante do HIV para testar a presença de anticorpos que o corpo produziu em resposta a uma infecção pelo HIV. O teste de DNA procura a presença de material genético do HIV por meio da reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR). O desenvolvimento do teste de RT-PCR foi possibilitado pela clonagem molecular e análise da sequência de genomas do HIV. Página de teste de HIV dos Centros de Controle de Doenças dos EUA (CDC)
Arroz dourado
Uma variedade de arroz recombinante que foi projetada para expressar as enzimas responsáveis ​​pela biossíntese de β-caroteno . Esta variedade de arroz é uma promessa substancial para reduzir a incidência de deficiência de vitamina A na população mundial. O arroz dourado não está em uso atualmente, enquanto se aguarda a resolução de questões regulatórias e de propriedade intelectual.
Culturas resistentes a herbicidas
Variedades comerciais de importantes culturas agrícolas (incluindo soja, milho / milho, sorgo, canola, alfafa e algodão) foram desenvolvidas para incorporar um gene recombinante que resulta em resistência ao herbicida glifosato (nome comercial Roundup ) e simplifica o controle de ervas daninhas pelo glifosato aplicativo. Essas safras são de uso comercial comum em vários países.
Culturas resistentes a insetos
Bacillus thuringeiensis é uma bactéria que produz naturalmente uma proteína ( toxina Bt ) com propriedades inseticidas. A bactéria tem sido aplicada em plantações como estratégia de controle de insetos por muitos anos, e essa prática foi amplamente adotada na agricultura e na jardinagem. Recentemente, foram desenvolvidas plantas que expressam uma forma recombinante da proteína bacteriana, que pode efetivamente controlar alguns predadores de insetos. As questões ambientais associadas ao uso dessas culturas transgênicas não foram totalmente resolvidas.

História

A ideia do DNA recombinante foi proposta pela primeira vez por Peter Lobban, um estudante de graduação do Prof. Dale Kaiser no Departamento de Bioquímica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. As primeiras publicações descrevendo a produção bem-sucedida e a replicação intracelular de DNA recombinante apareceram em 1972 e 1973, de Stanford e UCSF . Em 1980, Paul Berg , professor do Departamento de Bioquímica de Stanford e autor de um dos primeiros artigos, recebeu o Prêmio Nobel de Química por seu trabalho sobre ácidos nucléicos "com particular atenção ao DNA recombinante". Werner Arber , Hamilton Smith e Daniel Nathans compartilharam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1978 pela descoberta de endonucleases de restrição que aprimoraram as técnicas da tecnologia de rDNA.

A Universidade de Stanford solicitou uma patente dos EUA sobre DNA recombinante em 1974, listando os inventores como Herbert W. Boyer (professor da Universidade da Califórnia, San Francisco ) e Stanley N. Cohen (professor da Universidade de Stanford ); esta patente foi concedida em 1980. O primeiro medicamento licenciado gerado com a tecnologia de DNA recombinante foi a insulina humana, desenvolvida pela Genentech e licenciada pela Eli Lilly and Company .

Controvérsia

Cientistas associados ao desenvolvimento inicial de métodos de DNA recombinante reconheceram que existia o potencial de organismos contendo DNA recombinante terem propriedades indesejáveis ​​ou perigosas. Na Conferência Asilomar de 1975 sobre DNA recombinante , essas preocupações foram discutidas e uma moratória voluntária na pesquisa de DNA recombinante foi iniciada para experimentos considerados particularmente arriscados. Essa moratória foi amplamente observada até que o National Institutes of Health (EUA) elaborou e publicou diretrizes formais para o trabalho com rDNA. Hoje, as moléculas de DNA recombinante e as proteínas recombinantes geralmente não são consideradas perigosas. No entanto, persistem preocupações sobre alguns organismos que expressam DNA recombinante, principalmente quando saem do laboratório e são introduzidos no meio ambiente ou na cadeia alimentar. Essas preocupações são discutidas nos artigos sobre organismos geneticamente modificados e controvérsias sobre alimentos geneticamente modificados . Além disso, existem preocupações com os subprodutos da produção biofarmacêutica, onde o DNA recombinante resulta em produtos proteicos específicos. O principal subproduto, denominado proteína da célula hospedeira , vem do sistema de expressão do hospedeiro e representa uma ameaça à saúde do paciente e ao meio ambiente em geral.

Veja também

Referências

Leitura adicional

links externos