Channelrodopsina - Channelrhodopsin

Channelrhodopsins são uma subfamília de proteínas retinilideno ( rodopsinas ) que funcionam como canais iônicos dependentes de luz . Eles atuam como fotorreceptores sensoriais em algas verdes unicelulares , controlando a fototaxia : movimento em resposta à luz. Expressos em células de outros organismos, eles permitem que a luz controle a excitabilidade elétrica , a acidez intracelular , o influxo de cálcio e outros processos celulares (ver optogenética ). Channelrhodopsin-1 (ChR1) e Channelrhodopsin-2 (ChR2) do organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii são as primeiras channelrodopsinas descobertas. Variantes foram clonadas de outras espécies de algas e mais são esperadas.

Estrutura

Estrutura cristalina da channelrodopsina. PDB 3ug9

Em termos de estrutura, canalrodopsinas são proteínas retinilideno . São proteínas sete transmembrana, como a rodopsina , e contêm o cromóforo isomerizável à luz todo- trans - retinal (um aldeído derivado da vitamina A ). O cromóforo retinal está covalentemente ligado ao resto da proteína por meio de uma base de Schiff protonada . Enquanto a maioria das proteínas 7-transmembrana são receptores acoplados à proteína G que abrem outros canais iônicos indiretamente por meio de segundos mensageiros (ou seja, são metabotrópicos ), os canais rodopsinas formam diretamente canais iônicos (ou seja, são ionotrópicos ). Isso torna a despolarização celular extremamente rápida, robusta e útil para aplicações de bioengenharia e neurociência, incluindo fotoestimulação .

Função

Esquema de construção de fusão ChR2-RFP

O ChR2 natural ("tipo selvagem") absorve luz azul com um espectro máximo de absorção e ação em 480 nm. Quando o complexo todo- trans- retinal absorve um fóton , ele induz uma mudança conformacional de todo- trans para 13- cis- retinal. Esta mudança introduz outra na proteína transmembrana, abrindo o poro para pelo menos 6 Å. Em milissegundos, a retina relaxa de volta à forma totalmente trans, fechando o poro e interrompendo o fluxo de íons. A maioria dos channelrhodopsins naturais são canais catiônicos inespecíficos , conduzindo íons H + , Na + , K + e Ca 2+ . Recentemente, foram descobertas canais-rodopsinas condutoras de ânions .

Designer-channelrhodopsins

Channelrhodopsins são ferramentas essenciais em optogenética . A extremidade C-terminal do canal rodopsina-2 se estende para o espaço intracelular e pode ser substituída por proteínas fluorescentes sem afetar a função do canal. Este tipo de construção de fusão pode ser útil para visualizar a morfologia das células que expressam ChR2. Demonstrou-se que mutações pontuais próximas à bolsa de ligação da retina afetam as propriedades biofísicas do canal-rodopsina, resultando em uma variedade de ferramentas diferentes.

Cinética

O fechamento do canal após a ativação óptica pode ser substancialmente retardado pela mutação dos resíduos de proteína C128 ou D156. Essa modificação resulta em rodopsinas de canal super-sensíveis que podem ser abertas por um pulso de luz azul e fechadas por um pulso de luz verde ou amarela (opsinas de função de etapa). A mutação do resíduo E123 acelera a cinética do canal (ChETA), e os mutantes ChR2 resultantes foram usados ​​para aumentar os neurônios em até 200 Hz. Em geral, os canais-rodopsinas com cinética lenta são mais sensíveis à luz no nível da população, pois os canais abertos se acumulam ao longo do tempo, mesmo em baixos níveis de luz.

Amplitude fotocorrente

Os mutantes H134R e T159C exibem fotocorrentes aumentadas e uma combinação de T159 e E123 (ET / TC) tem fotocorrentes ligeiramente maiores e cinética ligeiramente mais rápida do que o ChR2 do tipo selvagem. Entre as variantes de ChR, ChIEF, uma quimera e mutante pontual de ChR1 e ChR2, demonstra as maiores fotocorrentes e a menor dessensibilização e tem cinética semelhante ao ChR2 do tipo selvagem.

Comprimento de onda

As channelrodopsinas quiméricas foram desenvolvidas combinando hélices transmembrana de ChR1 e VChR1, levando ao desenvolvimento de ChRs com desvios espectrais vermelhos (como C1V1 e ReaChR). ReaChR melhorou o tráfego de membrana e forte expressão em células de mamíferos, e tem sido usado para ativação transcraniana minimamente invasiva de motoneurônios do tronco cerebral . As pesquisas por sequências homólogas em outros organismos produziram channelrodpsinas deslocadas para o vermelho mais fortes e espectralmente melhoradas (Chrimson). Em combinação com ChR2, essas channelrodopsinas sensíveis à luz amarela / vermelha permitem controlar duas populações de neurônios independentemente com pulsos de luz de cores diferentes.

Um canal-rodopsina desviada para o azul foi descoberto na alga Scherffelia dubia . Depois de alguma engenharia para melhorar o tráfego e a velocidade da membrana, a ferramenta resultante (CheRiff) produziu grandes fotocorrentes com excitação de 460 nm. Ele foi combinado com o Indicador de Cálcio Geneticamente Codificado jRCaMP1b em um sistema totalmente óptico chamado OptoCaMP.

Seletividade de íons

A maioria das rodopsinas dos canais são canais catiônicos inespecíficos. Quando expressos em neurônios, eles conduzem principalmente íons Na + e, portanto, despolarizam . A mutação L132C (CatCh) aumenta a permeabilidade ao cálcio. A primeira channelrodopsina específica de K + foi descoberta recentemente em um protista semelhante a um fungo .

A mutação do E90 para o aminoácido arginina carregado positivamente transforma o canal rodopsina de um canal catiônico inespecífico em um canal condutor de cloreto (ChloC). A seletividade para Cl- foi ainda melhorada pela substituição de resíduos carregados negativamente no poro do canal, tornando o potencial de reversão mais negativo. As canalodopsinas condutoras de ânions (iChloC, iC ++, Gt ACR) inibem o aumento neuronal em cultura de células e em animais intactos quando iluminados com luz azul.

Formulários

As channelrodopsinas podem ser prontamente expressas em células excitáveis, como neurônios, usando uma variedade de técnicas de transfecção ( transfecção viral , eletroporação , arma de genes ) ou animais transgênicos . O pigmento retinal que absorve a luz está presente na maioria das células (de vertebrados ) como vitamina A , tornando possível fotoestimular os neurônios sem adicionar quaisquer compostos químicos. Antes da descoberta das canal-rodopsinas, os neurocientistas limitavam-se a registrar a atividade dos neurônios no cérebro e a correlacionar essa atividade com o comportamento. Isso não é suficiente para provar que a atividade neural registrada realmente causou aquele comportamento. O controle de redes de células geneticamente modificadas com luz, um campo emergente conhecido como Optogenética , permite que os pesquisadores explorem a ligação causal entre a atividade em um grupo específico de neurônios e os eventos mentais , por exemplo, a tomada de decisões . O controle óptico do comportamento foi demonstrado em nematóides, moscas-das-frutas, peixes-zebra e camundongos. Recentemente, canalrodopsinas condutoras de cloreto foram projetadas e também encontradas na natureza. Essas ferramentas podem ser usadas para silenciar neurônios em cultura de células e em animais vivos por inibição de desvio .

O uso de várias cores de luz expande as possibilidades de experimentos optogenéticos . O ChR2 sensível à luz azul e a bomba de cloreto ativada por luz amarela halorhodopsin juntos permitem ativação óptica de várias cores e silenciamento da atividade neural. O VChR1 da alga colonial Volvox carteri absorve no máximo a 535 nm e foi usado para estimular células com luz amarela (580 nm), embora as fotocorrentes geradas por VChR1 sejam tipicamente muito pequenas. No entanto, os híbridos VChR1-ChR2 foram desenvolvidos usando evolução direcionada que exibe excitação máxima em 560 nm e 50% do pico de absorbância em comprimentos de onda acima de 600 nm.

Usando ChR2 marcado com fluorescência, axônios e sinapses estimulados por luz podem ser identificados. Isso é útil para estudar os eventos moleculares durante a indução da plasticidade sináptica . Redes neuronais cultivadas transfectadas podem ser estimuladas a realizar alguns comportamentos desejados para aplicações em robótica e controle. O ChR2 também foi usado para mapear conexões de longo alcance de um lado do cérebro para o outro e para mapear a localização espacial de entradas na árvore dendrítica de neurônios individuais.

Os neurônios podem tolerar a expressão de ChR por um longo tempo, e vários laboratórios estão testando a estimulação optogenética para solucionar necessidades médicas. Em camundongos cegos, a função visual pode ser parcialmente restaurada pela expressão de ChR2 nas células internas da retina. Em 2021, o ChR ChrimsonR sensível à luz vermelha foi administrado com vírus aos olhos de um paciente humano que sofria de degeneração retinal ( retinite pigmentosa ), levando à recuperação parcial de sua visão. Os implantes cocleares ópticos têm demonstrado funcionar bem em experimentos com animais e atualmente estão passando por testes clínicos. No futuro, os ChRs podem encontrar ainda mais aplicações médicas, por exemplo, para estimulação cerebral profunda de pacientes com Parkinson ou para controlar certas formas de epilepsia .

História

A motilidade e a fotoorientação de microalgas ( fototaxia ) foram estudadas ao longo de mais de cem anos em muitos laboratórios em todo o mundo.

Em 1980, Ken Foster desenvolveu a primeira teoria consistente sobre a funcionalidade dos olhos de algas. Ele também analisou espectros de ação publicados e células cegas complementadas com retinal e análogos da retina, o que levou à conclusão de que o fotorreceptor para as respostas de motilidade em Chlorophyceae é a rodopsina .

Fotocorrentes de Chlorophyceae Heamatococcus pluvialis e Chlamydomonas reinhardtii foram estudadas ao longo de muitos anos nos grupos de Oleg Sineshchekov e Peter Hegemann , resultando em duas publicações seminais nos anos de 1978 e 1991. Com base em espectroscopia de ação e gravações simultâneas de fotocorrentes e batimento flagelar, foi determinado que as correntes fotorreceptoras e os movimentos flagelares subsequentes são mediados pela rodopsina e controlam a fototaxia e as respostas fotofóbicas. O aumento extremamente rápido da corrente do fotorreceptor após um breve flash de luz levou à conclusão de que a rodopsina e o canal estão intimamente ligados em um complexo proteico, ou mesmo dentro de uma única proteína.

No entanto, a purificação bioquímica do (s) fotorreceptor (es) da rodopsina não teve sucesso por muitos anos.

As sequências de nucleotídeos das rodopsinas agora chamadas de canalrodopsinas ChR1 e ChR2 foram finalmente descobertas em um projeto de sequenciamento de EST em grande escala em C. reinhardtii . A submissão independente das mesmas sequências ao GenBank por três grupos de pesquisa gerou confusão sobre sua nomenclatura: os nomes cop-3 e cop-4 foram usados ​​para a submissão inicial pelo grupo de Hegemann; CSOA e CSOB pelo grupo de Spudich; e acop-1 e acop-2 pelo grupo de Takahashi. Ambas as sequências funcionam como canais de cátions ativados por luz de um único componente em oócitos de Xenopus e células renais humanas (HEK) por Georg Nagel , Ernst Bamberg, Peter Hegemann e outros.

O nome "channelrhodopsin" foi cunhado para destacar essa propriedade incomum, e as sequências foram renomeadas de acordo. Enquanto isso, seus papéis na geração de correntes fotorreceptoras em células de algas foram caracterizados por Oleg Sineshchekov, Kwang-Hwan Jung e John Spudich, e Peter Berthold e Peter Hegemann.

Em novembro de 2004, Zhuo-Hua Pan submeteu um artigo à Nature relatando a restauração da visão em camundongos cegos transfectados com Channelrhodopsina, mas o artigo foi rejeitado e finalmente publicado na Neuron em 2006.

Enquanto isso, em 2005, três grupos estabeleceram sequencialmente o ChR2 como uma ferramenta para controle remoto óptico geneticamente direcionado ( optogenética ) de neurônios , circuitos neurais e comportamento.

A princípio, o laboratório de Karl Deisseroth (em um artigo publicado em agosto de 2005) demonstrou que ChR2 poderia ser implantado para controlar neurônios de mamíferos in vitro , alcançando precisão temporal na ordem de milissegundos (tanto em termos de atraso para spiking e em termos de jitter temporal). Esta foi uma descoberta significativa, uma vez que, em primeiro lugar, todas as opsinas (microbianas e também vertebradas) requerem retinal como cofator de detecção de luz e não estava claro se as células nervosas centrais dos mamíferos conteriam níveis retinais suficientes, mas elas contêm; segundo, mostrou, apesar da pequena condutância de canal único, potência suficiente para conduzir os neurônios dos mamíferos acima do limite do potencial de ação; e, terceiro, demonstrou que a canalrodopsina é a primeira ferramenta optogenética, com a qual a atividade neural poderia ser controlada com a precisão temporal com que os neurônios operam (milissegundos). Uma ferramenta anterior para fotoestimulação, cHARGe, demonstrou prova de princípio em neurônios cultivados, mas nunca foi usada por outros grupos, pois operava com uma precisão da ordem de segundos, era altamente variável e não permitia o controle dos potenciais de ação individuais .

Um segundo estudo foi publicado posteriormente pelos grupos de Peter Hegemann e Stefan Herlitze, confirmando a capacidade do ChR2 de controlar a atividade dos neurônios de vertebrados , neste momento na medula espinhal de pintinhos. Este estudo foi o primeiro em que ChR2 foi expresso ao lado de um silenciador óptico, rodopsina -4 de vertebrado, neste caso, demonstrando pela primeira vez que as células excitáveis ​​poderiam ser ativadas e silenciadas usando essas duas ferramentas simultaneamente, iluminando o tecido em diferentes comprimentos de onda.

Os grupos de Alexander Gottschalk e Ernst Bamberg (com Georg Nagel assumindo a liderança experimental) demonstraram que ChR2, se expresso em neurônios ou células musculares específicos, pode evocar comportamentos previsíveis, ou seja, pode controlar o sistema nervoso de um animal intacto, neste caso o invertebrado C. elegans . Este foi o primeiro usando ChR2 para orientar o comportamento de um animal em um experimento optogenético, tornando um tipo de célula geneticamente especificado sujeito ao controle remoto óptico. Embora ambos os aspectos tenham sido ilustrados no início daquele ano por outro grupo, o laboratório de Miesenböck , implantando o canal de íons indiretamente bloqueado por luz P2X2, foram as opsinas microbianas como o canal rodopsina que dominaram o campo do controle remoto geneticamente direcionado de células excitáveis, devido ao potência, velocidade, capacidade de direcionamento, facilidade de uso e precisão temporal de ativação óptica direta, não exigindo nenhum composto químico externo, como ligantes enjaulados.

Para superar suas principais desvantagens - a pequena condutância de canal único (especialmente em estado estacionário), a limitação de um comprimento de onda de excitação ideal (~ 470 nm, azul), bem como o tempo de recuperação relativamente longo, não permitindo disparo controlado de neurônios acima 20–40 Hz - ChR2 foi otimizado usando engenharia genética . Uma mutação pontual H134R (trocando o aminoácido Histidina na posição 134 da proteína nativa por uma arginina) resultou no aumento da condutância em estado estacionário, conforme descrito em um artigo de 2005 que também estabeleceu ChR2 como uma ferramenta optogenética em C. elegans . Em 2009, o laboratório de Roger Tsien otimizou ChR2 para aumentos adicionais na condutância de estado estacionário e reduziu drasticamente a dessensibilização criando quimeras de ChR1 e ChR2 e mutando aminoácidos específicos, produzindo ChEF e ChIEF, o que permitiu a condução de trens de potenciais de ação para cima a 100 Hz. Em 2010, os grupos de Hegemann e Deisseroth introduziram uma mutação E123T em ChR2 nativo, produzindo ChETA, que tem cinética on e off mais rápida , permitindo o controle de potenciais de ação individuais em frequências de até 200 Hz (em tipos de células apropriados).

Os grupos de Hegemann e Deisseroth também descobriram que a introdução da mutação de ponto C128S torna o derivado de ChR2 resultante uma ferramenta de função em etapas: Uma vez "ligado" pela luz azul, ChR2 (C128S) permanece no estado aberto até que seja ligado apagado pela luz amarela - uma modificação que deteriora a precisão temporal, mas aumenta a sensibilidade à luz em duas ordens de magnitude. Eles também descobriram e caracterizaram o VChR1 nas algas multicelulares Volvox carteri . O VChR1 produz apenas pequenas fotocorrentes, mas com um espectro de absorção que é desviado para o vermelho em relação ao ChR2. Usando partes da sequência ChR1, a amplitude da fotocorrente foi posteriormente melhorada para permitir a excitação de duas populações neuronais em dois comprimentos de onda distintos.

O grupo de Deisseroth foi pioneiro em muitas aplicações em animais vivos, como controle remoto geneticamente direcionado em roedores in vivo , a indução optogenética de aprendizagem em roedores, o tratamento experimental da doença de Parkinson em ratos e a combinação com fMRI (opto-fMRI). Outros laboratórios foram os pioneiros na combinação de estimulação ChR2 com imagens de cálcio para experimentos totalmente ópticos, mapeamento de circuitos neurais locais e de longo alcance, expressão de ChR2 de um locus transgênico - diretamente ou no paradigma condicional Cre-lox - bem como os dois - excitação de fóton de ChR2, permitindo a ativação de células individuais.

Em março de 2013, o Brain Prize (Grete Lundbeck European Brain Research Prize) foi concedido conjuntamente a Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck e Nagel por "sua invenção e refinamento da optogenética". No mesmo ano, Hegemann e Nagel receberam o Prêmio Louis-Jeantet de Medicina pela "descoberta da canalrodopsina". Em 2015, Boyden e Deisseroth receberam o Prêmio Revelação em Ciências da Vida e, em 2020, Miesenböck, Hegemann e Nagel receberam o prêmio Shaw em Ciências da Vida e Medicina pelo desenvolvimento da optogenética.

Referências

Leitura adicional

links externos