Sondas de lantanídeos - Lanthanide probes
As sondas de lantanídeos são uma ferramenta analítica não invasiva comumente usada para aplicações biológicas e químicas . Os lantanídeos são íons metálicos que têm seu nível de energia 4f preenchido e geralmente se referem aos elementos cério a lutécio na tabela periódica . A fluorescência dos sais de lantanídeos é fraca porque a absorção de energia do íon metálico é baixa; portanto, os complexos quelados de lantanídeos são mais comumente usados. O termo quelato deriva da palavra grega para "garra" e é aplicado para nomear ligantes, que se ligam a um íon metálico com dois ou mais átomos doadores por meio de ligações dativas. A fluorescência é mais intensa quando o íon metálico tem o estado de oxidação de 3+. Nem todos os metais lantanídeos podem ser usados e os mais comuns são: Sm (III), Eu (III), Tb (III) e Dy (III).
História
Sabe-se desde o início da década de 1930 que os sais de certos lantanídeos são fluorescentes. A reação de sais de lantanídeos com ácidos nucléicos foi discutida em uma série de publicações durante as décadas de 1930 e 1940, onde reagentes contendo lantânio foram empregados para a fixação de estruturas de ácido nucléico. Em 1942 , descobriu-se que complexos de európio , térbio e samário exibiam propriedades de luminescência incomuns quando excitados pela luz ultravioleta . No entanto, a primeira coloração de células biológicas com lantanídeos ocorreu vinte anos depois, quando esfregaços bacterianos de E. coli foram tratados com soluções aquosas de um complexo de európio, que sob iluminação de lâmpada de mercúrio apareceu como manchas vermelhas brilhantes. A atenção às sondas de lantanídeos aumentou muito em meados da década de 1970, quando os pesquisadores finlandeses propuseram os poliaminocarboxilatos Eu (III), Sm (III), Tb (III) e Dy (III) como sensores luminescentes em imunoensaios luminescentes resolvidos no tempo (TRL). A otimização de métodos analíticos a partir da década de 1970 para quelatos de lantanídeos e microscopia de luminescência resolvida no tempo (TRLM) resultou no uso de sondas de lantanídeos em muitos campos científicos, médicos e comerciais.
Técnicas
Existem duas técnicas principais de ensaio: heterogênea e homogênea. Se dois quelatos de lantanídeos são usados na análise, um após o outro, é chamado de ensaio heterogêneo. O primeiro analito está ligado a um agente de ligação específico em um suporte sólido, como um polímero e, em seguida, outra reação acopla o primeiro complexo de lantanídeo fracamente luminescente com um novo e melhor. Este método tedioso é usado porque o segundo composto mais luminescente não se ligaria sem o primeiro analito já presente. A detecção subsequente resolvida no tempo da sonda luminescente centrada no metal produz o sinal desejado. Antígenos , esteróides e hormônios são testados rotineiramente com técnicas heterogêneas. Os ensaios homogêneos dependem do acoplamento direto do marcador de lantanídeos com um aceitador orgânico.
O relaxamento dos estados das moléculas excitadas freqüentemente ocorre pela emissão de luz, que é chamada de fluorescência. Existem duas formas de medir essa radiação emitida: em função da frequência (inversa ao comprimento de onda ) ou do tempo. Convencionalmente, o espectro de fluorescência mostra a intensidade da fluorescência em diferentes comprimentos de onda, mas uma vez que os lantanídeos têm tempos de decaimento de fluorescência relativamente longos (variando de um microssegundo a um milissegundo), é possível registrar a emissão de fluorescência em diferentes tempos de decaimento da energia de excitação dada em tempo zero. Isso é chamado de espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo.
Mecanismo
Os lantanídeos podem ser usados porque seu tamanho pequeno ( raio iônico ) lhes dá a capacidade de substituir íons metálicos dentro de complexos de proteínas , como cálcio ou níquel . As propriedades ópticas dos íons lantanídeos como Ln (III) se originam nas características especiais de suas configurações eletrônicas [Xe] 4f n . Essas configurações geram muitos níveis eletrônicos, cujo número é dado por [14! / N! (14-n)!], Traduzindo-se em 3003 níveis de energia para Eu (III) e Tb (III).
As energias desses níveis são bem definidas devido à blindagem dos orbitais 4f pelas sub-camadas 5s e 5p preenchidas, e não são muito sensíveis aos ambientes químicos nos quais os íons lantanídeos são inseridos. As transições 4f-4f da camada interna abrangem as faixas de infravermelho próximo e visível. Eles são nítidos e facilmente reconhecíveis. Como essas transições são proibidas por paridade, os tempos de vida dos estados excitados são longos, o que permite o uso de espectroscopia resolvida no tempo , um recurso definitivo para bioensaios e microscopia. A única desvantagem das transições ff são as fracas forças do oscilador que podem de fato ser transformadas em uma vantagem.
A energia absorvida pelo receptor orgânico (ligante) é transferida para os estados excitados de Ln (III), e bandas de emissão agudas originadas do íon metálico são detectadas após rápida conversão interna para o nível de emissão. O fenômeno é denominado sensibilização do complexo centrado no metal (também conhecido como efeito de antena) e é bastante complexo. No entanto, o caminho de migração de energia passa pelo estado tripleto de longa duração do ligante. Os íons Ln (III) são bons inibidores de estados tripletos, de modo que o fotobranqueamento é substancialmente reduzido. Os três tipos de transições observadas para sondas de lantanídeos são: LMCT, 4f-5d e 4f-4f intraconfiguracional. Os dois primeiros geralmente ocorrem em energias muito altas para serem relevantes para bioaplicações.
Formulários
Pesquisa sobre câncer
Ferramentas de triagem para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer estão em alta demanda em todo o mundo e frequentemente requerem a determinação da cinética enzimática. A alta sensibilidade da luminescência dos lantanídeos, particularmente da luminescência resolvida no tempo, revelou-se um candidato ideal para esse propósito. Existem várias maneiras de conduzir essa análise pelo uso de substratos de enzimas fluorogênicas, substratos contendo grupos doadores / aceitadores que permitem a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e imunoensaios. Por exemplo, as proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina consistem em várias subunidades, uma das quais compreende as da subfamília Ras . As Ras GTPases atuam como interruptores binários, convertendo trifosfato de guadenosina ( GTP ) em difosfato de guadenosina ( GDP ). A luminescência do complexo Tb (III) com norfloxacina é sensível para determinar a concentração de fosfato liberado pela transformação de GTP em GDP.
sondas de pH
A protonação de sítios básicos em sistemas que compreendem um cromóforo e um centro de metal luminescente abre o caminho para os sensores de pH. Alguns sistemas propostos inicialmente eram baseados em derivados de piridina, mas estes não eram estáveis em água. Sensores mais robustos foram propostos em que o núcleo é um macrociclo substituído geralmente contendo fosfinato , carboxilato ou quatro grupos de coordenação de amida . Foi observado que a emissão da sonda luminescente de lantanídeos aumenta cerca de seis vezes ao diminuir o pH da solução de seis para dois.
Sensor de peróxido de hidrogênio
O peróxido de hidrogênio pode ser detectado com alta sensibilidade pela luminescência das sondas de lantanídeos - entretanto, apenas em valores de pH relativamente altos. Um procedimento analítico baseado em lantanídeos foi proposto em 2002 com base na descoberta de que o complexo de európio com várias tetraciclinas se liga ao peróxido de hidrogênio formando um complexo luminescente.
Estimando o tamanho da molécula e distâncias do átomo
FRET em sondas de lantanídeos é uma técnica amplamente usada para medir a distância entre dois pontos separados por aproximadamente 15–100 Angstrom. As medições podem ser feitas em condições fisiológicas in vitro com corantes geneticamente codificados e, frequentemente, também in vivo. A técnica se baseia em uma transferência de energia dependente da distância de um fluoróforo doador para um corante aceitador. As sondas de lantanídeos têm sido usadas para estudar as interações DNA-proteína (usando um complexo quelato de térbio ) para medir distâncias em complexos de DNA dobrados pela proteína CAP.
Conformação de proteína
As sondas de lantanídeos têm sido usadas para detectar mudanças conformacionais em proteínas. Recentemente, o canal de íon de potássio Shaker , um canal controlado por voltagem envolvido nos impulsos nervosos, foi medido usando esta técnica. Alguns cientistas também usaram a transferência de energia de ressonância de luminescência baseada em lantanídeos (LRET), que é muito semelhante ao FRET, para estudar mudanças conformacionais na RNA polimerase após a ligação ao DNA e a iniciação da transcrição em procariotos. O LRET também foi usado para estudar a interação das proteínas distrofina e actina nas células musculares. A distrofina está presente na membrana celular interna do músculo e acredita-se que estabilize as fibras musculares ao se ligar aos filamentos de actina. Utilizou-se distrofina especificamente marcada com anticorpos monoclonais marcados com Tb.
Virologia
Os procedimentos tradicionais de diagnóstico de vírus estão sendo substituídos por imunoensaios sensíveis com lantanídeos. A técnica baseada em fluorescência resolvida no tempo é geralmente aplicável e seu desempenho também foi testado no ensaio de antígenos virais em amostras clínicas.
Imagens médicas
Vários sistemas têm sido propostos que combinam a capacidade de MRI com sondas de lantanídeos em ensaios duplos. A sonda luminescente pode, por exemplo, servir para localizar o agente de contraste de MRI. Isso ajudou a visualizar a entrega de ácidos nucléicos em células em cultura. Os lantanídeos não são usados por sua fluorescência, mas por suas qualidades magnéticas.
Biologia - Interações receptor-ligante
As sondas de lantanídeos exibem propriedades de fluorescência únicas, incluindo longa vida útil de fluorescência, grande deslocamento de Stokes e pico de emissão estreito. Estas propriedades são altamente vantajosas para desenvolver sondas analíticas para interações receptor-ligante. Muitos estudos de fluorescência baseados em lantanídeos foram desenvolvidos para GPCRs , incluindo CXCR1 , receptor 2 de peptídeo da família semelhante à insulina, receptor 2 ativado por protease, receptor β2-adrenérgico e receptor C3a .
Instrumentação
Os fótons emitidos por lantanídeos excitados são detectados por dispositivos e técnicas altamente sensíveis, como a detecção de um único fóton. Se o tempo de vida do nível de emissão excitado for longo o suficiente, então a detecção resolvida no tempo (TRD) pode ser usada para aumentar a razão sinal-ruído. A instrumentação usada para realizar o LRET é relativamente simples, embora um pouco mais complexa do que os fluorímetros convencionais. Os requisitos gerais são uma fonte de excitação UV pulsada e detecção resolvida no tempo.
As fontes de luz que emitem pulsos de curta duração podem ser divididas nas seguintes categorias:
- Tubos de flash
- Lâmpadas de descarga mecanicamente ou eletronicamente cortadas
- Faíscas
- Lasers pulsados
Os fatores mais importantes na seleção da fonte de luz pulsada são a duração e a intensidade da luz. Lasers pulsados para a faixa de 300 a 500 nm agora substituíram as cápsulas de ignição na espectroscopia de fluorescência. Existem quatro tipos gerais de lasers pulsantes usados: lasers com excitação pulsada, lasers com comutação G, lasers bloqueados de modo e lasers com descarga de cavidade. Lasers de nitrogênio pulsado (337 nm) têm sido freqüentemente usados como uma fonte de excitação na fluorometria resolvida no tempo.
Na fluorometria resolvida no tempo, o tubo fotomultiplicador rápido é o único detector de fóton único prático. Uma boa resolução de fóton único também é uma vantagem na contagem de fótons de sondas fluorescentes de longo decaimento, como quelatos de lantanídeos.
Estes instrumentos comerciais estão disponíveis no mercado hoje: Perkin-Elmer Micro Filtro Fluorometer LS-2, Perkin-Elmer luminescência Spectrometer Modelo LS 5, e LKB-Wallac Time-Resolvido Fluorometer Modelo 1230.
Ligantes
Os ligantes das sondas de lantanídeos devem atender a vários requisitos químicos para que as sondas funcionem corretamente. Essas qualidades são: solubilidade em água, grande estabilidade termodinâmica em pHs fisiológicos , inércia cinética e absorção acima de 330 nm para minimizar a destruição de materiais biológicos vivos.
Os quelatos que foram estudados e utilizados até o momento podem ser classificados nos seguintes grupos:
- Quelatos Tris (três ligantes)
- Quelatos de Tetrakis (quatro ligantes)
- Complexos mistos de ligantes
- Complexos com doadores neutros
- Outros, como: complexos de ftalato , picrato e salicilato .
A eficiência da transferência de energia do ligante para o íon é determinada pela ligação ligante-metal. A transferência de energia é mais eficiente quando ligada covalentemente do que por ligação iônica. Os substituintes no ligando que são doadores de elétrons, como os grupos hidroxilo , metoxilo e metilo , aumentam a fluorescência. O efeito oposto é visto quando um grupo de retirada de elétrons (como o nitro) é anexado. Além disso, a intensidade da fluorescência é aumentada pela substituição do flúor no ligante. A transferência de energia para o íon metálico aumenta à medida que a eletronegatividade do grupo fluorado torna a ligação európio-oxigênio de natureza mais covalente. O aumento da conjugação por substituintes aromáticos pela substituição de grupos fenil por naftilo é mostrado para aumentar a fluorescência.