Transferência de energia de ressonância de Förster - Förster resonance energy transfer

Diagrama de Jablonski de FRET com escalas de tempo típicas indicadas. Observe que a linha tracejada preta indica um fóton virtual .

Förster ou transferência de energia de ressonância de fluorescência ( FRET ), transferência de energia de ressonância ( RET ) ou transferência de energia eletrônica ( EET ) é um mecanismo que descreve a transferência de energia entre duas moléculas sensíveis à luz ( cromóforos ). Um cromóforo doador, inicialmente em seu estado excitado eletrônico, pode transferir energia para um cromóforo aceitador por meio do acoplamento dipolo-dipolo não radiativo . A eficiência dessa transferência de energia é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre doador e aceitador, tornando o FRET extremamente sensível a pequenas mudanças na distância.

As medições da eficiência FRET podem ser usadas para determinar se dois fluoróforos estão a uma certa distância um do outro. Essas medições são usadas como uma ferramenta de pesquisa em áreas como biologia e química.

FRET é análogo à comunicação de campo próximo , em que o raio de interação é muito menor do que o comprimento de onda da luz emitida. Na região de campo próximo, o cromóforo excitado emite um fóton virtual que é absorvido instantaneamente por um cromóforo receptor. Esses fótons virtuais são indetectáveis, uma vez que sua existência viola a conservação de energia e momento e, portanto, FRET é conhecido como um mecanismo sem radiação . Cálculos eletrodinâmicos quânticos foram usados ​​para determinar que a transferência de energia sem radiação (FRET) e radiativa são as assíntotas de curto e longo alcance de um único mecanismo unificado.

Terminologia

Diagrama de desenho animado do conceito de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET).

A transferência de energia de ressonância de Förster deve o seu nome ao cientista alemão Theodor Förster . Quando ambos os cromóforos são fluorescentes, o termo "transferência de energia de ressonância de fluorescência" costuma ser usado, embora a energia não seja realmente transferida por fluorescência . Para evitar uma interpretação errônea do fenômeno que é sempre uma transferência não radiativa de energia (mesmo quando ocorre entre dois cromóforos fluorescentes), o nome "transferência de energia de ressonância de Förster" é preferível a "transferência de energia de ressonância de fluorescência"; no entanto, o último é de uso comum na literatura científica. FRET não está restrito à fluorescência e ocorre em conexão com a fosforescência também.

Base teórica

A eficiência FRET ( ) é o rendimento quântico da transição de transferência de energia, ou seja, a probabilidade do evento de transferência de energia ocorrer por evento de excitação do doador: ${\ displaystyle E}$

${\ displaystyle E = {\ frac {k _ {\ text {ET}}} {k_ {f} + k _ {\ text {ET}} + \ sum {k_ {i}}}},}$

onde é a taxa de transferência de energia, a taxa de decaimento radiativo do doador e as taxas de quaisquer outras vias de desexcitação, excluindo as transferências de energia para outros aceitadores. ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$${\ displaystyle k_ {f}}$${\ displaystyle k_ {i}}$

A eficiência FRET depende de muitos parâmetros físicos que podem ser agrupados como: 1) a distância entre o doador e o aceitador (normalmente na faixa de 1–10 nm), 2) a sobreposição espectral do espectro de emissão do doador e a absorção do aceitador espectro , e 3) a orientação relativa do momento de dipolo de emissão do doador e o momento de dipolo de absorção do aceitador.

${\ displaystyle E}$depende da distância de separação doador para aceitador com uma lei de 6ª potência inversa devido ao mecanismo de acoplamento dipolo-dipolo: ${\ displaystyle r}$

${\ displaystyle E = {\ frac {1} {1+ (r / R_ {0}) ^ {6}}}}$

com sendo a distância Förster deste par de dador e o aceitador, isto é, a distância à qual a eficiência de transferência de energia é 50%. A distância de Förster depende da sobreposição integral do espectro de emissão do doador com o espectro de absorção do aceitador e sua orientação molecular mútua, conforme expresso pela seguinte equação: ${\ displaystyle R_ {0}}$

${\ displaystyle {R_ {0}} ^ {6} = {\ frac {2.07} {128 \, \ pi ^ {5} \, N_ {A}}} \, {\ frac {\ kappa ^ {2} \, Q_ {D}} {n ^ {4}}} {\ int F _ {\ rm {D}} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm {A}} (\ lambda) \, \ lambda ^ {4} \, d \ lambda}}$

onde é o rendimento quântico de fluorescência do doador na ausência do aceitador, é o fator de orientação do dipolo, é o índice de refração do meio, é a constante de Avogadro e é a integral de sobreposição espectral calculada como ${\ displaystyle Q _ {\ text {D}}}$${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$${\ displaystyle n}$${\ displaystyle N _ {\ text {A}}}$${\ displaystyle J}$

${\ displaystyle J = {\ frac {\ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A}} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda} { \ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \, d \ lambda}} = \ int {\ overline {f _ {\ text {D}}}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A }} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda,}$

onde é o espectro de emissão do doador, é o espectro de emissão do doador normalizado para uma área de 1 e é o coeficiente de extinção molar aceitador , normalmente obtido a partir de um espectro de absorção. O fator de orientação κ é dado por ${\ displaystyle f _ {\ text {D}}}$${\ displaystyle {\ overline {f _ {\ text {D}}}}}$${\ displaystyle \ epsilon _ {\ text {A}}}$

${\ displaystyle \ kappa = {\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {\ mu}} _ {\ text {D}} - 3 ({\ hat {\ mu} } _ {\ text {D}} \ cdot {\ hat {R}}) ({\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {R}}),}$

onde denota o momento de dipolo de transição normalizado do respectivo fluoróforo e denota o deslocamento interfluoróforo normalizado. = 2/3 é freqüentemente assumido. Este valor é obtido quando ambos os corantes estão girando livremente e podem ser considerados isotropicamente orientados durante o tempo de vida no estado excitado. Se qualquer um dos corantes estiver fixo ou não estiver livre para girar, então = 2/3 não será uma suposição válida. Na maioria dos casos, entretanto, mesmo a reorientação modesta dos corantes resulta em média orientacional suficiente que = 2/3 não resulta em um grande erro na distância estimada de transferência de energia devido à dependência da sexta potência de em . Mesmo quando é bastante diferente de 2/3, o erro pode ser associado a uma mudança em e, portanto, as determinações de mudanças na distância relativa para um sistema particular ainda são válidas. As proteínas fluorescentes não se reorientam em uma escala de tempo mais rápida do que seu tempo de vida de fluorescência. Neste caso, 0 ≤ ≤ 4. ${\ displaystyle {\ hat {\ mu}} _ {i}}$${\ displaystyle {\ hat {R}}}$${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$${\ displaystyle R_ {0}}$${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$${\ displaystyle R_ {0}}$${\ displaystyle \ kappa ^ {2}}$

Para análises dependentes do tempo de FRET, a taxa de transferência de energia ( ) pode ser usada diretamente em seu lugar: ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$

${\ displaystyle k _ {\ text {ET}} = ({\ frac {R_ {0}} {r}}) ^ {6} \, {\ frac {1} {\ tau _ {D}}}}$

onde é o tempo de vida de fluorescência do doador na ausência do aceitador. ${\ displaystyle \ tau _ {D}}$

A eficiência FRET está relacionada ao rendimento quântico e ao tempo de vida de fluorescência da molécula doadora da seguinte forma:

${\ displaystyle E = 1- \ tau '_ {\ text {D}} / \ tau _ {\ text {D}},}$

onde e são os tempos de vida de fluorescência do doador na presença e ausência de um aceitador, respectivamente, ou como ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {D}} '}$${\ displaystyle \ tau _ {\ text {D}}}$

${\ displaystyle E = 1-F _ {\ text {D}} '/ F _ {\ text {D}},}$

onde e são as intensidades de fluorescência do doador com e sem um aceitador, respectivamente. ${\ displaystyle F _ {\ text {D}} '}$${\ displaystyle F _ {\ text {D}}}$

Confirmação experimental da teoria de transferência de energia de ressonância de Förster

A dependência inversa distância sexta potência de Förster transferência de energia de ressonância foi confirmada experimentalmente por Wilchek , Edelhoch e Marca utilizando péptidos triptofilo. Stryer , Haugland e Yguerabide também demonstraram experimentalmente a dependência teórica da transferência de energia de ressonância de Förster na integral de sobreposição usando um indolosteróide fundido como doador e uma cetona como aceitador. No entanto, muitas contradições de experimentos especiais com a teoria foram observadas. A razão é que a teoria tem caráter aproximado e dá distâncias superestimadas de 50–100 ångströms.

Métodos para medir a eficiência FRET

Em microscopia de fluorescência , microscopia de varredura a laser confocal de fluorescência , bem como em biologia molecular , FRET é uma ferramenta útil para quantificar a dinâmica molecular em biofísica e bioquímica , como interações proteína- proteína, interação proteína- DNA e alterações conformacionais de proteína. Para monitorar a formação do complexo entre duas moléculas, uma delas é marcada com um doador e a outra com um aceptor. A eficiência FRET é medida e usada para identificar as interações entre os complexos rotulados. Existem várias maneiras de medir a eficiência do FRET monitorando as alterações na fluorescência emitida pelo doador ou aceitador.

Emissão sensibilizada

Um método de medição da eficiência FRET é medir a variação na intensidade de emissão do aceitador. Quando o doador e o aceitador estão próximos (1–10 nm) devido à interação das duas moléculas, a emissão do aceitador aumentará por causa do FRET intermolecular do doador para o aceitador. Para monitorar as alterações conformacionais da proteína, a proteína alvo é marcada com um doador e um aceitador em dois loci. Quando uma torção ou curvatura da proteína traz a mudança na distância ou orientação relativa do doador e do aceitador, a mudança FRET é observada. Se uma interação molecular ou uma alteração conformacional da proteína é dependente da ligação do ligante, esta técnica FRET é aplicável a indicadores fluorescentes para a detecção do ligante.

Fotobranqueamento FRET

Eficiências FRET também podem ser inferidas das taxas de fotodegradação do doador na presença e ausência de um aceitador. Este método pode ser executado na maioria dos microscópios de fluorescência; um simplesmente ilumina a luz de excitação (de uma frequência que excitará o doador, mas não o aceitador significativamente) em amostras com e sem o fluoróforo aceitador e monitora a fluorescência do doador (normalmente separada da fluorescência do aceitador usando um filtro passa - banda ) ao longo do tempo. A escala de tempo é a de fotodegradação, que é de segundos a minutos, com fluorescência em cada curva sendo dada por

${\ displaystyle {\ text {background}} + {\ text {constant}} \ cdot e ^ {- {\ text {time}} / \ tau _ {\ text {pb}}},}$

onde é a constante de tempo de decaimento do fotodegradação e depende se o aceitador está presente ou não. Uma vez que o fotobranqueamento consiste na inativação permanente de fluoróforos excitados, a transferência de energia de ressonância de um doador excitado para um fluoróforo aceitador impede o fotobranqueamento desse fluoróforo doador e, portanto, a alta eficiência FRET leva a uma constante de tempo de decaimento de fotobranqueamento mais longa: ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}}}$

${\ displaystyle E = 1- \ tau _ {\ text {pb}} / \ tau _ {\ text {pb}} ',}$

onde e são as constantes de tempo de decaimento do fotodegradação do doador na presença e na ausência do aceitador, respectivamente. (Observe que a fração é o recíproco daquela usada para medições ao longo da vida). ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}} '}$${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}}}$

Esta técnica foi introduzida por Jovin em 1989. Seu uso de uma curva inteira de pontos para extrair as constantes de tempo pode dar vantagens de precisão sobre os outros métodos. Além disso, o fato de que as medições de tempo duram mais de segundos em vez de nanossegundos torna mais fácil do que medições de vida útil de fluorescência, e porque as taxas de decaimento de fotobranqueamento geralmente não dependem da concentração do doador (a menos que a saturação do aceitador seja um problema), o controle cuidadoso das concentrações necessárias para a intensidade medições não são necessárias. É, no entanto, importante manter a iluminação igual para as medições com e sem aceitador, pois o fotodegradação aumenta acentuadamente com luz incidente mais intensa.

Medidas de vida

A eficiência do FRET também pode ser determinada a partir da mudança no tempo de vida da fluorescência do doador. O tempo de vida do doador diminuirá na presença do aceitador. As medições ao longo da vida do doador FRET são utilizadas em microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM).

Fluoróforos usados ​​para FRET

Se o linker estiver intacto, a excitação no comprimento de onda de absorbância de CFP (414nm) causa emissão por YFP (525nm) devido a FRET. Se o linker for clivado por uma protease, FRET é abolido e a emissão está no comprimento de onda CFP (475 nm).

Pares CFP-YFP

Um par comum de fluoróforos para uso biológico é um par de proteína fluorescente ciano (CFP) - proteína fluorescente amarela (YFP). Ambos são variantes de cor da proteína fluorescente verde (GFP). A marcação com corantes fluorescentes orgânicos requer purificação, modificação química e injeção intracelular de uma proteína do hospedeiro. As variantes de GFP podem ser anexadas a uma proteína hospedeira por engenharia genética, o que pode ser mais conveniente. Além disso, uma fusão de CFP e YFP ("dímero em tandem") ligados por uma sequência de clivagem de protease pode ser usada como um ensaio de clivagem.

BRET

Uma limitação do FRET realizado com doadores de fluoróforo é a necessidade de iluminação externa para iniciar a transferência de fluorescência, o que pode levar a ruído de fundo nos resultados da excitação direta do aceptor ou fotobranqueamento . Para evitar essa desvantagem, a transferência de energia de ressonância de bioluminescência (ou BRET ) foi desenvolvida. Esta técnica usa uma luciferase bioluminescente (normalmente a luciferase de Renilla reniformis ) em vez de CFP para produzir uma emissão inicial de fótons compatível com YFP.

BRET também foi implementado usando uma enzima luciferase diferente, desenvolvida a partir do camarão de profundidade Oplophorus gracilirostris . Esta luciferase é menor (19 kD) e mais brilhante do que a luciferase mais comumente usada de Renilla reniformis . E foi chamada de NanoLuc ou NanoKAZ. A Promega desenvolveu um substrato patenteado para NanoLuc chamado furimazine, embora outros substratos valiosos de coelenterazina para NanoLuc também tenham sido publicados. Uma versão de proteína dividida de NanoLuc foi desenvolvida pela Promega, que também foi usada como um doador de BRET em experimentos que medem as interações proteína-proteína

Homo-FRET

Em geral, "FRET" refere-se a situações em que as proteínas doadoras e aceitadoras (ou "fluoróforos") são de dois tipos diferentes. Em muitas situações biológicas, no entanto, os pesquisadores podem precisar examinar as interações entre duas ou mais proteínas do mesmo tipo - ou, de fato, a mesma proteína com ela mesma, por exemplo, se a proteína se dobra ou faz parte de uma cadeia polimérica de proteínas ou para outras questões de quantificação em células biológicas.

Obviamente, as diferenças espectrais não serão a ferramenta usada para detectar e medir FRET, já que tanto a proteína aceitadora quanto a doadora emitem luz com os mesmos comprimentos de onda. Ainda assim, os pesquisadores podem detectar diferenças na polarização entre a luz que excita os fluoróforos e a luz que é emitida, em uma técnica chamada de imagem de anisotropia FRET; o nível de anisotropia quantificada (diferença na polarização entre os feixes de excitação e emissão) torna-se então um guia indicativo de quantos eventos FRET aconteceram.

Outros

Vários compostos além de proteínas fluorescentes.

Formulários

As aplicações de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) se expandiram tremendamente nos últimos 25 anos, e a técnica se tornou um grampo em muitos campos biológicos e biofísicos . FRET pode ser usado como uma régua espectroscópica para medir distâncias e detectar interações moleculares em vários sistemas e tem aplicações em biologia e bioquímica.

Proteínas

FRET é freqüentemente usado para detectar e rastrear interações entre proteínas. Além disso, FRET pode ser usado para medir distâncias entre domínios em uma única proteína marcando diferentes regiões da proteína com fluoróforos e medindo a emissão para determinar a distância. Isso fornece informações sobre a conformação da proteína , incluindo estruturas secundárias e dobramento de proteínas . Isso se estende ao rastreamento de mudanças funcionais na estrutura da proteína, como mudanças conformacionais associadas à atividade da miosina . Aplicado in vivo, FRET tem sido usado para detectar a localização e as interações de estruturas celulares, incluindo integrinas e proteínas de membrana .

Membranas

FRET pode ser usado para observar a fluidez da membrana , o movimento e a dispersão das proteínas da membrana, as interações proteína-proteína e lipídio da membrana e a mistura bem-sucedida de diferentes membranas. FRET também é usado para estudar a formação e as propriedades dos domínios da membrana e jangadas de lipídios nas membranas celulares e para determinar a densidade da superfície nas membranas.

Quimiossensorial

Sonda baseada em FRET que é ativada mediante interação com Cd2 +

As sondas baseadas em FRET podem detectar a presença de várias moléculas: a estrutura da sonda é afetada pela ligação ou atividade de pequenas moléculas, que podem ligar ou desligar o sistema FRET. Isso é frequentemente usado para detectar ânions, cátions, pequenas moléculas não carregadas e também algumas biomacromoléculas maiores. Da mesma forma, os sistemas FRET foram projetados para detectar mudanças no ambiente celular devido a fatores como pH , hipóxia ou potencial de membrana mitocondrial .

Vias de sinalização

Outro uso do FRET é no estudo de vias metabólicas ou de sinalização . Por exemplo, FRET e BRET foram usados ​​em vários experimentos para caracterizar a ativação do receptor acoplado à proteína G e consequentes mecanismos de sinalização. Outros exemplos incluem o uso de FRET para analisar diversos processos como a quimiotaxia bacteriana e a atividade da caspase na apoptose .

Outras aplicações

Além dos usos comuns mencionados anteriormente, FRET e BRET também são eficazes no estudo da cinética de reação bioquímica. FRET é cada vez mais usado para monitorar a montagem e desmontagem dependente do pH e é valioso na análise de ácidos nucléicos . Esta técnica pode ser usada para determinar fatores que afetam vários tipos de formação de nanopartículas , bem como os mecanismos e efeitos das nanomedicinas .

Outros métodos

Um mecanismo diferente, mas relacionado, é a transferência de elétrons de Dexter .

Um método alternativo para detectar a proximidade proteína-proteína é a complementação de fluorescência bimolecular (BiFC), onde duas partes de uma proteína fluorescente são fundidas a outras proteínas. Quando essas duas partes se encontram, elas formam um fluoróforo em uma escala de tempo de minutos ou horas.

Veja também

• Transferência de elétrons de Dexter
• Acoplamento Förster
• Transferência de energia de superfície
• Transferência de energia de fluorescência resolvida no tempo

Referências

links externos

• Efeito FRET em um filme fino no YouTube
• FRET Imaging (Tutorial de Becker & Hickl, site)