Luciferase - Luciferase

Família de monooxigenase de luciferase bacteriana
Identificadores
Símbolo Bac_luciferase
Pfam PF00296
InterPro IPR016048
PRÓSITO PDOC00397
SCOP2 1nfp / SCOPe / SUPFAM
Domínio catalítico de dinoflagelado luciferase
PDB 1vpr EBI.jpg
estrutura cristalina de um domínio de luciferase do dinoflagelado Lingulodinium polyedrum
Identificadores
Símbolo Luciferase_cat
Pfam PF10285
InterPro IPR018804
Domínio N-terminal de dinoflagelado Luciferase / LBP
Identificadores
Símbolo Luciferase_N
Pfam PF05295
InterPro IPR007959
Domínio do pacote helicoidal de dinoflagelado luciferase
Identificadores
Símbolo Luciferase_3H
Pfam PF10284
InterPro IPR018475

Luciferase é um termo genérico para a classe de enzimas oxidativas que produzem bioluminescência e geralmente é distinguido de uma fotoproteína . O nome foi usado pela primeira vez por Raphaël Dubois, que inventou as palavras luciferina e luciferase, para enzima e , respectivamente. Ambas as palavras são derivadas da palavra latina lúcifer , que significa "portador da luz", que por sua vez é derivada das palavras latinas para "luz" ( lux) e "trazer ou carregar" ( ferre) .

Luciferase de vagalume
Firefly Luciferase Crystal Structure.rsh.png
Estrutura da luciferase do pirilampo Photinus pyralis .
Identificadores
Organismo Photinus pyralis
Símbolo Luciferase de vagalume
PDB 1LCI Mais estruturas
UniProt P08659
Outros dados
Número CE 1.13.12.7

Luciferases são amplamente utilizadas em biotecnologia , para microscopia e como genes repórter , para muitas das mesmas aplicações das proteínas fluorescentes . No entanto, ao contrário das proteínas fluorescentes, as luciferases não requerem uma fonte de luz externa , mas requerem a adição de luciferina , o substrato consumível.

Exemplos

Uma variedade de organismos regulam sua produção de luz usando diferentes luciferases em uma variedade de reações de emissão de luz. A maioria das luciferases estudadas foi encontrada em animais, incluindo vaga-lumes e muitos animais marinhos, como copépodes , medusas e amores-perfeitos . No entanto, as luciferases foram estudadas em fungos luminosos, como o cogumelo Jack-O-Lantern , bem como em exemplos em outros reinos, incluindo bactérias luminosas e dinoflagelados .

Vaga-lume e besouro de clique

As luciferases de vaga - lumes - das quais existem mais de 2.000 espécies - e de outras Elateroidea (besouros clicadores e parentes em geral) são diversas o suficiente para serem úteis na filogenia molecular . Nos vaga-lumes, o oxigênio necessário é fornecido por um tubo no abdômen chamado traquéia abdominal . Uma luciferase bem estudado é o do Photinini pirilampo Photinus pyralis , que tem um pH óptimo de 7,8.

Amor-perfeito do mar

Também bem estudado é o amor-perfeito do mar , Renilla reniformis . Neste organismo, a luciferase ( Renilla-luciferina 2-monooxigenase ) está intimamente associada a uma proteína de ligação à luciferina, bem como a uma proteína fluorescente verde ( GFP ). O cálcio desencadeia a liberação da luciferina ( coelenterazina ) da proteína de ligação à luciferina. O substrato fica então disponível para oxidação pela luciferase, onde é degradado a coelenteramida com a liberação de energia resultante. Na ausência de GFP, essa energia seria liberada como um fóton de luz azul (comprimento de onda de emissão de pico 482 nm). No entanto, devido ao GFP intimamente associado, a energia liberada pela luciferase é, em vez disso, acoplada por meio da transferência de energia de ressonância ao fluoróforo do GFP e, subsequentemente, é liberada como um fóton de luz verde (comprimento de onda de emissão de pico 510 nm). A reação catalisada é:

Copépode

Recentemente, foram identificadas luciferases mais recentes que, ao contrário de outras luciferases, são moléculas secretadas naturalmente. Um exemplo é a luciferase dependente de Metridia coelenterazina (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) que é derivada do copépode marinho Metridia longa . O gene da luciferase secretada por Metridia longa codifica uma proteína de 24 kDa contendo um peptídeo sinal secretor N-terminal de 17 resíduos de aminoácidos . A sensibilidade e a alta intensidade de sinal desta molécula de luciferase se mostram vantajosas em muitos estudos de repórter. Alguns dos benefícios de usar uma molécula repórter secretada como MetLuc é seu protocolo de não-lise, que permite a realização de ensaios de células vivas e ensaios múltiplos na mesma célula.

Bacteriana

A bioluminescência bacteriana é observada em espécies de Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi e Vibrio harveyi . A emissão de luz em algumas bactérias bioluminescentes utiliza 'antena', como a proteína lumazine para aceitar a energia do estado excitado primário na luciferase, resultando em um cromóforo de lulnazina excitado que emite luz de comprimento de onda mais curto (mais azul), enquanto em outros usar uma proteína fluorescente amarela (YFP) com FMN como o cromóforo e emite luz que é deslocada para o vermelho em relação à luciferase.

Dinoflagelado

A luciferase do dinoflagelado é uma proteína eucariota de múltiplos domínios , que consiste em um domínio N-terminal e três domínios catalíticos , cada um precedido por um domínio de feixe helicoidal. A estrutura do domínio catalítico da dinoflagelada luciferase foi resolvida. A parte central do domínio é um barril beta de 10 fitas que é estruturalmente semelhante às lipocalinas e FABP . O domínio N-terminal é conservado entre a luciferase do dinoflagelado e as proteínas de ligação da luciferina (LBPs). Foi sugerido que esta região pode mediar uma interação entre LBP e luciferase ou sua associação com a membrana vacuolar . O domínio do feixe helicoidal tem uma estrutura de feixe de três hélices que contém quatro histidinas importantes que parecem desempenhar um papel na regulação do pH da enzima . Há uma grande bolsa no barril β da luciferase de dinoflagelado em pH 8 para acomodar o substrato de tetrapirrol , mas não há nenhuma abertura para permitir a entrada do substrato. Portanto, uma mudança conformacional significativa deve ocorrer para fornecer acesso e espaço para um ligante no sítio ativo e a fonte para essa mudança é através dos quatro resíduos de histidina N-terminal. Em pH 8, pode ser visto que os resíduos de histidina não protonados estão envolvidos em uma rede de ligações de hidrogênio na interface das hélices no feixe que bloqueia o acesso do substrato ao sítio ativo e a interrupção desta interação por protonação (em pH 6,3) ou por substituição dos resíduos de histidina por alanina causa um grande movimento molecular do feixe, separando as hélices em 11Å e abrindo o sítio catalítico. Logicamente, os resíduos de histidina não podem ser substituídos por alanina na natureza, mas esta substituição experimental confirma ainda que os resíduos maiores de histidina bloqueiam o sítio ativo. Além disso, três sequências Gly-Gly, uma na hélice N-terminal e duas no motivo hélice-alça-hélice, poderiam servir como dobradiças em torno das quais as cadeias giram a fim de abrir ainda mais o caminho para o sítio catalítico e ampliar o ativo local.

Uma luciferase dinoflagelado é capaz de emitir luz devido à sua interacção com o seu substrato ( luciferina ) e a proteína de ligação a luciferina (LBP) no scintillon organelo encontrado em dinoflagelados. A luciferase atua de acordo com a luciferina e o LBP para emitir luz, mas cada componente funciona em um pH diferente. A luciferase e seus domínios não são ativos em pH 8, mas são extremamente ativos em pH ideal de 6,3, enquanto a LBP se liga à luciferina em pH 8 e a libera em pH 6,3. Consequentemente, a luciferina só é liberada para reagir com uma luciferase ativa quando o cintilão é acidificado a pH 6,3. Portanto, a fim de baixar o pH, os canais dependentes de voltagem na membrana do cintilão são abertos para permitir a entrada de prótons de um vacúolo que possui um potencial de ação produzido a partir de uma estimulação mecânica. Assim, pode-se observar que o potencial de ação na membrana vacuolar leva à acidificação e isso, por sua vez, permite que a luciferina seja liberada para reagir com a luciferase no cintilão, produzindo um flash de luz azul.

Mecanismo de reação

Todas as luciferases são classificadas como oxidorredutases ( EC 1.13.12.- ), o que significa que atuam em doadores únicos com incorporação de oxigênio molecular. Como as luciferases são de várias famílias de proteínas não relacionadas, não há mecanismo de unificação, pois qualquer mecanismo depende da combinação de luciferase e luciferina. No entanto, foi demonstrado que todas as reações de luciferase-luciferina caracterizadas até agora requerem oxigênio molecular em algum estágio.

Luciferase bacteriana

A reação catalisada pela luciferase bacteriana também é um processo oxidativo:

  • FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + luz

Na reação, o oxigênio molecular oxida o mononucleotídeo de flavina e um aldeído alifático de cadeia longa em um ácido carboxílico alifático . A reação forma um intermediário de hidroxiflavina excitado, que é desidratado no produto FMN para emitir luz azul esverdeada.

Quase toda a energia que entra na reação é transformada em luz. A reação é de 80% a 90% eficiente. Em comparação, a lâmpada incandescente converte apenas cerca de 10% de sua energia em luz e um LED de 150 lúmen por Watt (lm / W) converte 20% da energia de entrada em luz visível.

Formulários

As luciferases podem ser produzidas em laboratório por meio da engenharia genética para diversos fins. Os genes da luciferase podem ser sintetizados e inseridos em organismos ou transfectados em células. Em 2002, ratos , bichos-da-seda e batatas são apenas alguns dos organismos que já foram projetados para produzir a proteína.

Na reação da luciferase, a luz é emitida quando a luciferase atua no substrato de luciferina apropriado . A emissão de fótons pode ser detectada por aparelhos sensíveis à luz, como luminômetro ou microscópios ópticos modificados . Isso permite a observação de processos biológicos. Uma vez que a excitação de luz não é necessária para a bioluminescência da luciferase, há autofluorescência mínima e, portanto, fluorescência virtualmente livre de fundo. Portanto, tão pouco quanto 0,02 pg ainda pode ser medido com precisão usando um contador de cintilação padrão .

Na pesquisa biológica, a luciferase é comumente usada como um repórter para avaliar a atividade transcricional em células que são transfectadas com uma construção genética contendo o gene da luciferase sob o controle de um promotor de interesse. Além disso, as moléculas proluminescentes que são convertidas em luciferina após a atividade de uma determinada enzima podem ser usadas para detectar a atividade da enzima em ensaios de luciferase acoplada ou em duas etapas. Esses substratos têm sido usados ​​para detectar a atividade da caspase e a atividade do citocromo P450 , entre outras.

A luciferase também pode ser usada para detectar o nível de ATP celular em ensaios de viabilidade celular ou para ensaios de atividade de quinase. A luciferase pode atuar como uma proteína sensora de ATP por meio da biotinilação . A biotinilação irá imobilizar a luciferase na superfície celular ao se ligar a um complexo estreptavidina - biotina . Isso permite que a luciferase detecte o efluxo de ATP da célula e exibirá efetivamente a liberação em tempo real de ATP por meio da bioluminescência. A luciferase pode, adicionalmente, ser tornada mais sensível para a detecção de ATP, aumentando a intensidade da luminescência, alterando certos resíduos de aminoácidos na sequência da proteína.

Imagens de animais inteiros (chamadas de imagens in vivo em vida ou, de outra forma, chamadas de imagens ex vivo ) são uma técnica poderosa para estudar populações de células em animais vivos, como camundongos. Diferentes tipos de células (por exemplo, células-tronco da medula óssea, células T) podem ser projetadas para expressar uma luciferase, permitindo sua visualização não invasiva dentro de um animal vivo usando uma câmera de dispositivo de carga-dupla sensível ( câmera CCD ). Esta técnica foi usada. para acompanhar a tumorigênese e a resposta de tumores ao tratamento em modelos animais. No entanto, fatores ambientais e interferências terapêuticas podem causar algumas discrepâncias entre a carga tumoral e a intensidade da bioluminescência em relação às mudanças na atividade proliferativa. A intensidade do sinal medido por imagem in vivo pode depender de vários fatores, como a absorção de D-luciferina pelo peritônio, fluxo sanguíneo, permeabilidade da membrana celular, disponibilidade de co-fatores, pH intracelular e transparência do tecido sobreposto, além de a quantidade de luciferase.

A luciferase é uma proteína sensível ao calor usada em estudos de desnaturação de proteínas , testando a capacidade protetora das proteínas de choque térmico . As oportunidades de uso da luciferase continuam a se expandir.

Veja também

Referências

links externos

Este artigo incorpora texto do domínio público Pfam e InterPro : IPR018804
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Este artigo incorpora texto de domínio público Pfam e InterPro : IPR018475