Ensaio de viabilidade - Viability assay
Um ensaio de viabilidade é um ensaio criado para determinar a capacidade de órgãos , células ou tecidos de manter ou recuperar um estado de sobrevivência. A viabilidade pode ser distinguida dos estados tudo ou nada de vida e morte pelo uso de um índice quantificável que varia entre os números inteiros de 0 e 1 ou, se mais facilmente compreendido, o intervalo de 0% e 100%. A viabilidade pode ser observada por meio das propriedades físicas das células, tecidos e órgãos. Alguns deles incluem atividade mecânica, motilidade, como com espermatozóides e granulócitos , a contração do tecido muscular ou células, atividade mitótica nas funções celulares e muito mais. Os ensaios de viabilidade fornecem uma base mais precisa para a medição do nível de vitalidade de um organismo.
Os ensaios de viabilidade podem levar a mais descobertas do que a diferença entre vivos e não vivos. Essas técnicas podem ser usadas para avaliar o sucesso das técnicas de cultura de células, técnicas de criopreservação , a toxicidade de substâncias ou a eficácia das substâncias na mitigação dos efeitos das substâncias tóxicas.
Métodos comuns
Embora técnicas visuais simples de observação da viabilidade possam ser úteis, pode ser difícil medir completamente a viabilidade de um organismo / parte de um organismo apenas usando a observação de propriedades físicas. No entanto, há uma variedade de protocolos comuns utilizados para observação adicional da viabilidade usando ensaios.
- Redução de tetrazólio: uma maneira útil de localizar e medir a viabilidade é completar um ensaio de redução de tetrazólio. O aspecto de tetrazólio deste ensaio, que utiliza cargas positivas e negativas em sua fórmula, promove a distinção da viabilidade celular em uma amostra.
- Redução da resazurina: os ensaios de redução da resazurina têm um desempenho muito próximo ao de um ensaio de tetrazólio, exceto que usam o poder do redox para alimentar sua capacidade de representar a viabilidade celular.
- Marcador de viabilidade de protease: pode-se observar a função de protease em espécimes se desejar direcionar a viabilidade em células; esta prática em pesquisa é conhecida como "Conceito de Ensaio de Marcador de Viabilidade de Protease". As ações da protease cessam quando uma célula morre, então uma linha bem definida é traçada para determinar a viabilidade celular ao usar essa técnica.
- ATP: ATP é uma molécula de energia comum sobre a qual muitos pesquisadores têm amplo conhecimento, o que leva a como se entende os ensaios de viabilidade. O conceito de ensaio de ATP é uma técnica bem conhecida para determinar a viabilidade de células usando a avaliação de ATP e um método conhecido como "luciferase do pirilampo".
- Relação sódio-potássio: Outro tipo de ensaio pratica o exame da relação de potássio para sódio em células para servir como um indicador de viabilidade. Se as células não têm potássio intracelular alto e sódio intracelular baixo, então (1) a membrana celular pode não estar intacta e / ou (2) a bomba de sódio-potássio pode não estar funcionando bem.
- Citólise ou vazamento de membrana: Esta categoria inclui o ensaio de lactato desidrogenase . Ensaios como esses contêm uma enzima estável comum em todas as células que pode ser facilmente detectada quando as membranas celulares não estão mais intactas. Exemplos deste tipo de ensaio incluem iodeto de propídio , azul de tripano , e 7-Aminoactinomycin D .
- Actividade mitocondrial ou caspase: Resazurina e formazan ( MTT / XTT) pode ensaiar a várias fases da apoptose processo de morte celular que prefigura.
- Funcional: os ensaios de função celular serão altamente específicos para os tipos de células que estão sendo testados. Por exemplo, a motilidade é um ensaio amplamente utilizado da função dos espermatozoides. A sobrevivência dos gametas geralmente pode ser usada para avaliar a fertilidade . Os glóbulos vermelhos foram avaliados em termos de deformabilidade , fragilidade osmótica , hemólise , nível de ATP e conteúdo de hemoglobina . Para órgãos inteiros transplantáveis , o teste final é a capacidade de sustentar a vida após o transplante, um teste que não é útil na prevenção do transplante de órgãos não funcionais.
- Genômica e proteômica: as células podem ser testadas quanto à ativação das vias de estresse usando microarrays de DNA e chips de proteína.
- Citometria de fluxo: a automação permite a análise de milhares de células por segundo.
Como acontece com muitos tipos de ensaios de viabilidade, as medidas quantitativas da função fisiológica não indicam se a reparação e recuperação do dano é possível. Um ensaio da capacidade de uma linha celular de aderir e se dividir pode ser mais indicativo de dano incipiente do que integridade da membrana.
Frogging and tadpoling
"Frogging" é um tipo de método de ensaio de viabilidade que utiliza uma placa de ágar para o seu ambiente e consiste em plaquear diluições em série fixando-as após terem sido diluídas no líquido. Algumas de suas limitações incluem que não leva em conta a viabilidade total e não é particularmente sensível a ensaios de baixa viabilidade; no entanto, é conhecido por seu ritmo rápido. "Tadpoling", que é um método praticado após o desenvolvimento de "frogging", é semelhante ao método "frogging", mas suas células de teste são diluídas em líquido e então mantidas em líquido durante o processo de exame. O método "tadpoling" pode ser usado para medir com precisão a viabilidade da cultura, que é o que retrata sua principal separação do "frogging".
Lista de métodos de ensaio de viabilidade
- Calcein AM
- Ensaio clonogênico
- Ensaio de homodímero de etídio
- Evans azul
- Hidrólise de diacetato de fluoresceína / coloração com iodeto de propídio (coloração FDA / PI)
- Citometria de fluxo
- Ensaios baseados em Formazan ( MTT / XTT)
- Proteína fluorescente verde
- Lactato desidrogenase (LDH)
- Violeta de metila
- Absorção de vermelho neutro ( mancha vital )
- Iodeto de propídio , mancha de ADN que pode diferenciar necróticas , apoptóticas e normais células .
- Resazurina
- Ensaio TUNEL