Vetores em terapia gênica - Vectors in gene therapy
A terapia gênica utiliza a entrega de DNA às células, o que pode ser realizado por vários métodos, resumidos a seguir. As duas classes principais de métodos são aqueles que usam vírus recombinantes (às vezes chamados de nanopartículas biológicas ou vetores virais) e aqueles que usam DNA nu ou complexos de DNA (métodos não virais).
Vírus
Todos os vírus se ligam a seus hospedeiros e introduzem seu material genético na célula hospedeira como parte de seu ciclo de replicação. Esse material genético contém 'instruções' básicas de como produzir mais cópias desses vírus, hackeando a maquinaria de produção normal do corpo para atender às necessidades do vírus. A célula hospedeira seguirá essas instruções e produzirá cópias adicionais do vírus, fazendo com que mais e mais células sejam infectadas. Alguns tipos de vírus inserem seu genoma no citoplasma do hospedeiro, mas não entram realmente na célula. Outros penetram na membrana celular disfarçados de moléculas de proteína e entram na célula.
Existem dois tipos principais de infecção por vírus: lítica e lisogênica . Pouco depois de inserir seu DNA, os vírus do ciclo lítico produzem rapidamente mais vírus, explodem da célula e infectam mais células. Os vírus lisogênicos integram seu DNA no DNA da célula hospedeira e podem viver no corpo por muitos anos antes de responder a um gatilho. O vírus se reproduz como a célula e não causa danos corporais até que seja acionado. O gatilho libera o DNA do hospedeiro e o utiliza para criar novos vírus.
Retrovírus
O material genético em retrovírus está na forma de moléculas de RNA , enquanto o material genético de seus hospedeiros está na forma de DNA. Quando um retrovírus infecta uma célula hospedeira, ele introduz seu RNA junto com algumas enzimas, a saber, a transcriptase reversa e a integrase , na célula. Essa molécula de RNA do retrovírus deve produzir uma cópia de DNA de sua molécula de RNA antes de ser integrada ao material genético da célula hospedeira. O processo de produção de uma cópia de DNA a partir de uma molécula de RNA é denominado transcrição reversa . É realizada por uma das enzimas carregadas no vírus, chamada transcriptase reversa . Depois que essa cópia de DNA é produzida e fica livre no núcleo da célula hospedeira, ela deve ser incorporada ao genoma da célula hospedeira. Ou seja, deve ser inserido nas grandes moléculas de DNA da célula (os cromossomos). Esse processo é feito por outra enzima carregada no vírus chamada integrase .
Agora que o material genético do vírus foi inserido, pode-se dizer que a célula hospedeira foi modificada para conter novos genes. Se essa célula hospedeira se dividir posteriormente, todos os seus descendentes conterão os novos genes. Às vezes, os genes do retrovírus não expressam suas informações imediatamente.
Um dos problemas da terapia genética com retrovírus é que a enzima integrase pode inserir o material genético do vírus em qualquer posição arbitrária no genoma do hospedeiro; ele insere aleatoriamente o material genético em um cromossomo. Se acontecer de o material genético ser inserido no meio de um dos genes originais da célula hospedeira, esse gene será interrompido ( mutagênese por inserção ). Se o gene for um regulador da divisão celular, pode ocorrer divisão celular descontrolada (ou seja, câncer ). Este problema começou recentemente a ser resolvido utilizando nucleases de dedo de zinco ou incluindo certas sequências, como a região de controle do locus beta-globina para direcionar o local de integração para locais cromossômicos específicos.
Os ensaios de terapia gênica usando vetores retrovirais para tratar a imunodeficiência combinada grave ligada ao X (X-SCID) representam a aplicação mais bem-sucedida da terapia gênica até o momento. Mais de vinte pacientes foram tratados na França e na Grã-Bretanha, com uma alta taxa de reconstituição do sistema imunológico observada. Ensaios semelhantes foram restritos ou interrompidos nos EUA quando a leucemia foi relatada em pacientes tratados no ensaio francês de terapia genética X-SCID. Até o momento, quatro crianças no estudo francês e uma no estudo britânico desenvolveram leucemia como resultado de mutagênese inserível pelo vetor retroviral. Todas essas crianças, exceto uma, responderam bem ao tratamento anti-leucêmico convencional. Os ensaios de terapia gênica para tratar SCID devido à deficiência da enzima Adenosina Desaminase ( ADA ) (uma forma de SCID) continuam com relativo sucesso nos EUA, Grã-Bretanha, Irlanda, Itália e Japão.
Adenovírus
Os adenovírus são vírus que carregam seu material genético na forma de DNA de fita dupla. Eles causam infecções respiratórias, intestinais e oculares em humanos (especialmente o resfriado comum). Quando esses vírus infectam uma célula hospedeira, eles introduzem sua molécula de DNA no hospedeiro. O material genético dos adenovírus não é incorporado (transitório) ao material genético da célula hospedeira. A molécula de DNA é deixada livre no núcleo da célula hospedeira, e as instruções nessa molécula de DNA extra são transcritas como qualquer outro gene. A única diferença é que esses genes extras não são replicados quando a célula está prestes a se dividir, então os descendentes dessa célula não terão o gene extra.
Como resultado, o tratamento com o adenovírus exigirá a readministração em uma população de células em crescimento, embora a ausência de integração no genoma da célula hospedeira deva prevenir o tipo de câncer visto nos ensaios de SCID. Este sistema de vetor foi promovido para o tratamento do câncer e, de fato, o primeiro produto de terapia genética licenciado para tratar o câncer, Gendicina , é um adenovírus. Gendicine, uma terapia genética baseada em p53 adenoviral foi aprovada pelos reguladores de alimentos e medicamentos chineses em 2003 para o tratamento de câncer de cabeça e pescoço. O Advexin, uma abordagem de terapia genética semelhante ao Introgen, foi rejeitado pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos em 2008.
As preocupações sobre a segurança dos vetores de adenovírus foram levantadas após a morte de Jesse Gelsinger em 1999, enquanto ele participava de um estudo de terapia genética. Desde então, o trabalho com vetores de adenovírus tem se concentrado em versões geneticamente mutiladas do vírus.
Pseudotipagem de proteína de envelope de vetores virais
Os vetores virais descritos acima têm populações de células hospedeiras naturais que infectam de forma mais eficiente. Os retrovírus têm faixas de células hospedeiras naturais limitadas e, embora o adenovírus e o vírus adeno-associado sejam capazes de infectar uma faixa relativamente mais ampla de células de maneira eficiente, alguns tipos de células também são resistentes à infecção por esses vírus. A adesão e a entrada em uma célula suscetível são mediadas pelo envelope de proteína na superfície de um vírus. Os retrovírus e os vírus adeno-associados têm uma única proteína revestindo sua membrana, enquanto os adenovírus são revestidos por uma proteína do envelope e por fibras que se estendem da superfície do vírus. As proteínas do envelope em cada um desses vírus ligam-se às moléculas da superfície celular , como o sulfato de heparina , que as localiza na superfície do hospedeiro potencial, bem como ao receptor de proteína específico que induz mudanças estruturais de promoção de entrada na proteína viral , ou localiza o vírus em endossomas em que a acidificação do lúmen induz esta redobragem do revestimento viral . Em ambos os casos, a entrada em células hospedeiras potenciais requer uma interação favorável entre uma proteína na superfície do vírus e uma proteína na superfície da célula.
Para fins de terapia gênica, pode-se querer limitar ou expandir a gama de células suscetíveis à transdução por um vetor de terapia gênica. Para este fim, foram desenvolvidos muitos vetores nos quais as proteínas endógenas do envelope viral foram substituídas por proteínas do envelope de outros vírus ou por proteínas quiméricas. Tal quimera consistiria nas partes da proteína viral necessárias para incorporação no vírion, bem como sequências destinadas a interagir com proteínas específicas da célula hospedeira. Os vírus nos quais as proteínas do envelope foram substituídas conforme descrito são referidos como vírus pseudotipados . Por exemplo, o vetor retroviral mais popular para uso em testes de terapia genética tem sido o lentivírus do vírus da imunodeficiência símia revestido com as proteínas do envelope, a proteína G , do vírus da estomatite vesicular . Este vetor é conhecido como lentivírus pseudotipado VSV G e infecta um conjunto quase universal de células. Este tropismo é característico da proteína G do VSV com a qual este vetor é revestido. Muitas tentativas têm sido feitas para limitar o tropismo de vetores virais a uma ou algumas populações de células hospedeiras. Esse avanço permitiria a administração sistêmica de uma quantidade relativamente pequena de vetor. O potencial para modificação de células fora do alvo seria limitado e muitas preocupações da comunidade médica seriam atenuadas. A maioria das tentativas de limitar o tropismo usou proteínas de envelope quiméricas contendo fragmentos de anticorpos . Esses vetores são uma grande promessa para o desenvolvimento de terapias gênicas de "bala mágica".
Vetores competentes para replicação
Um vetor competente para replicação denominado ONYX-015 é usado na replicação de células tumorais. Verificou-se que, na ausência da proteína viral E1B-55Kd, o adenovírus causou apoptose muito rápida de células p53 (+) infectadas, e isso resulta em uma redução drástica da descendência do vírus e nenhuma propagação subsequente. A apoptose foi principalmente o resultado da capacidade do EIA de inativar o p300. Em células p53 (-), a deleção de E1B 55kd não tem consequências em termos de apoptose e a replicação viral é semelhante à do vírus de tipo selvagem, resultando na morte em massa de células.
Um vetor com defeito de replicação exclui alguns genes essenciais. Esses genes deletados ainda são necessários no corpo, então eles são substituídos por um vírus auxiliar ou uma molécula de DNA.
Elementos cis e trans-atuantes
Os vetores com defeito de replicação sempre contêm uma “construção de transferência”. A construção de transferência carrega o gene a ser transduzido ou "transgene". A construção de transferência também carrega as sequências que são necessárias para o funcionamento geral do genoma viral: sequência de empacotamento, repetições para replicação e, quando necessário, iniciação da transcrição reversa. Esses são denominados elementos de ação cis, porque precisam estar no mesmo pedaço de DNA que o genoma viral e o gene de interesse. Elementos de ação trans são elementos virais, que podem ser codificados em uma molécula de DNA diferente. Por exemplo, as proteínas estruturais virais podem ser expressas a partir de um elemento genético diferente do genoma viral.
Vírus Herpes simplex
O vírus herpes simplex é um vírus neurotrópico humano. Isso é examinado principalmente para a transferência de genes no sistema nervoso. O vírus HSV-1 de tipo selvagem é capaz de infectar neurônios e evitar a resposta imune do hospedeiro, mas ainda pode ser reativado e produzir um ciclo lítico de replicação viral. Portanto, é típico usar cepas mutantes de HSV-1 que são deficientes em sua capacidade de replicação. Embora o vírus latente não seja transcricionalmente aparente, ele possui promotores específicos de neurônios que podem continuar a funcionar normalmente. Os anticorpos para o HSV-1 são comuns em humanos, no entanto, complicações devido à infecção por herpes são um tanto raras. Deve-se ter cuidado com os casos raros de encefalite e isso fornece alguma justificativa para o uso do HSV-2 como vetor viral, pois geralmente tem tropismo para células neuronais que inervam a área urogenital do corpo e poderia, então, poupar o hospedeiro de patologia grave no cérebro .
Métodos não virais
Os métodos não virais apresentam certas vantagens sobre os métodos virais, sendo apenas duas a produção simples em grande escala e a baixa imunogenicidade do hospedeiro. Anteriormente, os baixos níveis de transfecção e expressão do gene colocavam os métodos não virais em desvantagem; no entanto, avanços recentes na tecnologia de vetores produziram moléculas e técnicas com eficiências de transfecção semelhantes às dos vírus.
Injeção de DNA nu
Este é o método mais simples de transfecção não viral. Os ensaios clínicos realizados com injeção intramuscular de um plasmídeo de DNA nu ocorreram com algum sucesso; no entanto, a expressão tem sido muito baixa em comparação com outros métodos de transfecção. Além de testes com plasmídeos, houve testes com produtos de PCR simples , que tiveram sucesso semelhante ou maior. A captação celular de DNA nu é geralmente ineficiente. Os esforços de pesquisa com foco na melhoria da eficiência da captação de DNA nu produziram vários métodos novos, como eletroporação , sonoporação e o uso de uma " arma genética ", que atira partículas de ouro revestidas de DNA na célula usando gás de alta pressão.
Métodos físicos para melhorar a entrega
Eletroporação
Eletroporação é um método que usa pulsos curtos de alta voltagem para transportar DNA através da membrana celular. Acredita-se que esse choque cause a formação temporária de poros na membrana celular, permitindo a passagem das moléculas de DNA. A eletroporação é geralmente eficiente e funciona em uma ampla gama de tipos de células. No entanto, uma alta taxa de morte celular após eletroporação limitou seu uso, incluindo aplicações clínicas.
Mais recentemente, um novo método de eletroporação, denominado transfecção de elétron-avalanche, foi usado em experimentos de terapia genética. Usando uma descarga de plasma de alta voltagem, o DNA foi distribuído com eficiência seguindo pulsos muito curtos (microssegundos). Em comparação com a eletroporação, a técnica resultou em um grande aumento da eficiência e menos danos celulares.
Arma genética
O uso de bombardeio de partículas, ou arma genética , é outro método físico de transfecção de DNA. Nessa técnica, o DNA é revestido com partículas de ouro e carregado em um dispositivo que gera uma força para conseguir a penetração do DNA nas células, deixando o ouro para trás em um disco de "parada".
Sonoporação
A sonoporação usa frequências ultrassônicas para entregar DNA às células. Acredita-se que o processo de cavitação acústica rompe a membrana celular e permite que o DNA se mova para dentro das células.
Magnetofecção
Em um método denominado magnetofecção , o DNA é complexado a partículas magnéticas e um ímã é colocado sob a placa de cultura de tecidos para colocar os complexos de DNA em contato com uma monocamada de células.
Entrega hidrodinâmica
A administração hidrodinâmica envolve a injeção rápida de um grande volume de uma solução na vasculatura (como na veia cava inferior , ducto biliar ou veia da cauda ). A solução contém moléculas que devem ser inseridas nas células, como plasmídeos de DNA ou siRNA , e a transferência dessas moléculas para as células é auxiliada pela elevada pressão hidrostática causada pelo alto volume de solução injetada.
Métodos químicos para melhorar a entrega
Oligonucleotídeos
O uso de oligonucleotídeos sintéticos em terapia gênica visa desativar os genes envolvidos no processo da doença. Existem vários métodos pelos quais isso é feito. Uma estratégia usa antisense específico para o gene alvo para interromper a transcrição do gene defeituoso. Outro usa pequenas moléculas de RNA chamadas siRNA para sinalizar a célula para clivar sequências únicas específicas no transcrito de mRNA do gene defeituoso, interrompendo a tradução do mRNA defeituoso e, portanto, a expressão do gene. Uma estratégia adicional usa oligodeoxinucleotídeos de fita dupla como um chamariz para os fatores de transcrição que são necessários para ativar a transcrição do gene alvo. Os fatores de transcrição ligam-se aos chamarizes em vez do promotor do gene defeituoso, o que reduz a transcrição do gene alvo, diminuindo a expressão. Além disso, os oligonucleotídeos de DNA de fita simples têm sido usados para direcionar uma mudança de base única dentro de um gene mutante. O oligonucleotídeo é projetado para se emparelhar com complementaridade ao gene alvo, com exceção de uma base central, a base alvo, que serve como base modelo para reparo. Esta técnica é referida como reparo de gene mediado por oligonucleotídeo, reparo de gene direcionado ou alteração de nucleotídeo direcionado.
Lipoplexos
Para melhorar a entrega do novo DNA na célula, o DNA deve ser protegido de danos e carregado positivamente. Inicialmente, lipídios aniônicos e neutros foram usados para a construção de lipoplexos para vetores sintéticos. No entanto, apesar do fato de haver pouca toxicidade associada a eles, que são compatíveis com os fluidos corporais e que havia a possibilidade de adaptá-los para serem tecidos específicos; eles são complicados e demorados para produzir, então a atenção foi voltada para as versões catiônicas.
Os lipídios catiônicos , devido à sua carga positiva, foram usados pela primeira vez para condensar moléculas de DNA carregadas negativamente de modo a facilitar a encapsulação de DNA em lipossomas. Mais tarde, descobriu-se que o uso de lipídios catiônicos aumentava significativamente a estabilidade dos lipoplexos. Também como resultado de sua carga, os lipossomas catiônicos interagem com a membrana celular, e a endocitose era amplamente considerada a principal via pela qual as células captam lipoplexos. Os endossomos são formados como resultado da endocitose, no entanto, se os genes não puderem ser liberados no citoplasma pela quebra da membrana do endossomo, eles serão enviados para os lisossomas, onde todo o DNA será destruído antes que possam realizar suas funções. Também foi descoberto que embora os próprios lipídios catiônicos pudessem condensar e encapsular DNA em lipossomas, a eficiência de transfecção é muito baixa devido à falta de capacidade em termos de “escape endossômico”. No entanto, quando lipídios auxiliares (geralmente lipídios eletroneutros, como DOPE) foram adicionados para formar lipoplexos, foi observada uma eficiência de transfecção muito maior. Posteriormente, descobriu-se que certos lipídios têm a capacidade de desestabilizar as membranas endossômicas de modo a facilitar o escape do DNA do endossomo, por isso esses lipídios são chamados de lipídios fusogênicos. Embora os lipossomas catiônicos tenham sido amplamente usados como uma alternativa para vetores de entrega de genes, uma toxicidade dependente da dose de lipídeos catiônicos também foi observada, o que poderia limitar seus usos terapêuticos.
O uso mais comum de lipoplexos tem sido na transferência de genes para células cancerosas, onde os genes fornecidos têm genes de controle supressores de tumor ativados na célula e diminuem a atividade dos oncogenes. Estudos recentes mostraram que os lipoplexos são úteis na transfecção de células epiteliais respiratórias .
Polymersomes
Polymersomes são versões sintéticas de lipossomas ( vesículas com uma bicamada lipídica ), feitos de copolímeros anfifílicos em bloco . Eles podem encapsular conteúdos hidrofílicos ou hidrofóbicos e podem ser usados para entregar cargas como DNA, proteínas ou drogas às células. As vantagens dos polimerssomas em relação aos lipossomas incluem maior estabilidade, resistência mecânica, tempo de circulação sanguínea e capacidade de armazenamento.
Poliplexos
Os complexos de polímeros com DNA são chamados de poliplexos. A maioria dos poliplexos consiste em polímeros catiônicos e sua fabricação é baseada na automontagem por interações iônicas. Uma diferença importante entre os métodos de ação dos poliplexos e lipoplexos é que os poliplexos não podem liberar diretamente sua carga de DNA no citoplasma. Como resultado, a co-transfecção com agentes endossomo-líticos, como adenovírus inativado, foi necessária para facilitar o escape de nanopartículas da vesícula endocítica feita durante a absorção de partículas. No entanto, uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais o DNA pode escapar da via endolisossômica, ou seja, o efeito da esponja de prótons, desencadeou novas estratégias de síntese de polímeros, como a incorporação de resíduos protonáveis na estrutura do polímero e revitalizou a pesquisa em sistemas baseados em policatiões.
Devido à sua baixa toxicidade, alta capacidade de carga e facilidade de fabricação, os nanocarreadores policatiônicos demonstram grande promessa em comparação com seus rivais, como vetores virais que mostram alta imunogenicidade e potencial carcinogenicidade e vetores à base de lipídios que causam toxicidade dependente da dose. Polietilenoimina e quitosana estão entre os transportadores poliméricos que foram extensivamente estudados para o desenvolvimento de terapêuticas de entrega de genes. Outros transportadores policatiônicos, como poli (beta-aminoésteres) e polifosforamidato, estão sendo adicionados à biblioteca de transportadores de genes potenciais. Além da variedade de polímeros e copolímeros, a facilidade de controlar o tamanho, a forma, a química da superfície desses nano-portadores poliméricos lhes dá uma vantagem na capacidade de direcionamento e aproveitando a permeabilidade aprimorada e o efeito de retenção.
Dendrimers
Um dendrímero é uma macromolécula altamente ramificada com uma forma esférica. A superfície da partícula pode ser funcionalizada de muitas maneiras e muitas das propriedades da construção resultante são determinadas por sua superfície.
Em particular, é possível construir um dendrímero catiônico, ou seja, um com uma carga superficial positiva. Quando na presença de material genético, como DNA ou RNA, a complementaridade de carga leva a uma associação temporária do ácido nucleico com o dendrímero catiônico. Ao chegar ao seu destino, o complexo dendrímero-ácido nucleico é então levado para a célula por endocitose.
Nos últimos anos, a referência para agentes de transfecção tem sido os lipídios catiônicos. As limitações destes reagentes concorrentes foram relatadas como incluindo: a falta de capacidade de transfectar alguns tipos de células, a falta de capacidades robustas de direcionamento ativo, incompatibilidade com modelos animais e toxicidade. Os dendrímeros oferecem construção covalente robusta e controle extremo sobre a estrutura da molécula e, portanto, o tamanho. Juntos, eles oferecem vantagens atraentes em comparação com as abordagens existentes.
A produção de dendrímeros tem sido historicamente um processo lento e caro, consistindo em inúmeras reações lentas, um obstáculo que restringiu severamente seu desenvolvimento comercial. A empresa Dendritic Nanotechnologies, sediada em Michigan, descobriu um método para produzir dendrímeros usando química dirigida cineticamente, um processo que não apenas reduziu o custo em uma magnitude de três, mas também reduziu o tempo de reação de mais de um mês para vários dias. Esses novos dendrímeros "Priostar" podem ser especificamente construídos para transportar uma carga útil de DNA ou RNA que transfecta as células em alta eficiência com pouca ou nenhuma toxicidade.
Nanopartículas inorgânicas
Nanopartículas inorgânicas, como ouro , sílica , óxido de ferro (ex. Magnetofecção ) e fosfatos de cálcio , mostraram ser capazes de entrega de genes. Alguns dos benefícios dos vetores inorgânicos estão em sua estabilidade de armazenamento, baixo custo de fabricação e, muitas vezes, tempo, baixa imunogenicidade e resistência ao ataque microbiano. Foi demonstrado que materiais nanométricos com menos de 100 nm prendem com eficiência o DNA ou RNA e permitem seu escape do endossomo sem degradação. Os inorgânicos também mostraram exibir transfecção in vitro melhorada para linhas de células anexadas devido à sua densidade aumentada e localização preferencial na base da placa de cultura. Os pontos quânticos também têm sido usados com sucesso e permitem o acoplamento da terapia gênica com um marcador de fluorescência estável. Nanopartículas orgânicas projetadas também estão em desenvolvimento, que podem ser usadas para co-entrega de genes e agentes terapêuticos.
Peptídeos de penetração celular
Os peptídeos que penetram nas células (CPPs), também conhecidos como domínios de transdução de peptídeos (PTDs), são peptídeos curtos (<40 aminoácidos) que passam de forma eficiente através das membranas celulares enquanto são ligados covalentemente ou não covalentemente a várias moléculas, facilitando assim essas moléculas ' entrada nas células. A entrada nas células ocorre principalmente por endocitose, mas também existem outros mecanismos de entrada. Exemplos de moléculas de carga de CPPs incluem ácidos nucléicos , lipossomas e drogas de baixo peso molecular.
A carga de CPP pode ser direcionada para organelas celulares específicas, incorporando sequências de localização em sequências de CPP. Por exemplo, as sequências de localização nuclear são comumente usadas para guiar a carga de CPP para o núcleo. Para orientação sobre as mitocôndrias, uma sequência de direcionamento mitocondrial pode ser usada; esse método é usado na proteção (uma técnica que permite que o DNA mitocondrial estranho seja inserido nas mitocôndrias das células).
Métodos híbridos
Devido a todos os métodos de transferência de genes terem deficiências, alguns métodos híbridos foram desenvolvidos que combinam duas ou mais técnicas. Virossomas são um exemplo; eles combinam lipossomas com um vírus inativado de HIV ou influenza . Este demonstrou ter uma transferência de genes mais eficiente nas células epiteliais respiratórias do que os métodos virais ou lipossomais isolados. Outros métodos envolvem a mistura de outros vetores virais com lipídios catiônicos ou vírus de hibridização .