SmURFP - SmURFP

Proteínas fluorescentes visualizam a progressão do ciclo celular. A fluorescência IFP2.0-hGem (1/110) é mostrada em verde e destaca as fases S / G 2 / M. A fluorescência smURFP-hCdtI (30/120) é mostrada em vermelho e destaca as fases G 0 / G 1 .

Pequena proteína fluorescente ultra-vermelho ( smURFP ) é uma classe de extrema-vermelho proteína fluorescente evoluiu de uma cianobactérias ( Trichodesmium erythraeum ) ficobiliproteína , α- aloficocianina . A α- aloficocianina nativa requer uma proteína exógena, conhecida como liase , para ligar o cromóforo , ficocianobilina . Ficocianobilina não está presente em células de mamíferos . smURFP foi evoluiu para covalentemente anexar phycocyanobilin sem uma liase e fluoresce , covalentemente anexar biliverdina (ubíquo a mamíferos células ) e fluorescência , azul de deslocamento de fluorescência para coincidir com a orgânico fluoróforo , Cy5 , e não inibem a E. coli crescimento. smURFP foi encontrado após 12 rodadas de mutagênese aleatória e triagem manual de 10.000.000 de colônias bacterianas .

Propriedades

smURFP é um homodímero com absorção e emissão máximas de 642 nm e 670 nm, respectivamente. Um dímero tandem smURFP (TDsmURFP) foi criado e tem propriedades semelhantes a smURFP. smURFP é extremamente estável, com meia-vida de degradação de proteínas de 17 horas e 33 horas sem e com cromóforo ( biliverdina ), respectivamente. Isso é comparável à meia-vida de degradação da proteína da proteína fluorescente verde aprimorada derivada de medusa ( eGFP ) de 24 horas. smURFP é extremamente fotoestável e supera o desempenho do mCherry e do tdTomato em células vivas. O coeficiente de extinção (180.000 M −1 cm −1 ) de smURFP é extremamente grande e tem um rendimento quântico modesto (0,20), o que torna o brilho biofísico comparável ao eGFP e ~ 2 vezes mais brilhante do que a maioria das proteínas fluorescentes vermelhas ou vermelhas derivado de coral . Apesar de ser um homodímero, todas as fusões N- e C-terminais testadas mostram localização celular correta, incluindo a difícil fusão para α-tubulina e Lamin B1 ( Figura ). smURFP tem o nome dos Smurfs , devido à sua aparência azul claro na luz branca.

Uma planilha Excel dos espectros de absorção, excitação e emissão de smURFP pode ser baixada aqui . A estrutura cristalina de um mutante smURFP ( PDB : 6FZN ) foi publicada em Fuenzalida-Werner et al . Uma revisão de 2020 discute aplicações recentes de smURFP como uma sonda codificada geneticamente ou exógena para imagens in vivo e discute problemas com a disponibilidade de biliverdina .

A imagem mostra E. coli expressando smURFP, peletização de E. coli , remoção de mídia, lise de E. coli , ligação de smURFP a NiNTA, eluição de smURFP e troca de tampão.

smURFP usado como nanopartículas, sondas exógenas e ensaios in vitro

SmURFP livre tem 2-3 nm de diâmetro. Nanopartículas de smURFP de ~ 10-14 nm de diâmetro podem ser sintetizadas em uma emulsão de óleo e água e permanecem fluorescentes . Estas nanopartículas de proteína fluorescente são estáveis ​​em camundongos vivos e úteis para imagens de fluorescência de tumor não invasivo .

SmURFP livre, purificado de proteínas e não geneticamente codificados, podem ser encapsulados em vírus e usado para não-invasiva , a fluorescência imagiologia de biodistribuição em ratos vivos.

smURFP anexa covalentemente a biliverdina para ativar a fluorescência e é inerentemente um sensor de biliverdina . Os pesquisadores mostraram que o smURFP purificado tem um limite de detecção de 0,4 nM para biliverdina no soro humano . smURFP permite a criação de ensaios in vitro para detectar a atividade enzimática . Um ensaio foi desenvolvido para trombina com uma faixa de detecção de 1,07 aM – 0,01 mM e um limite de detecção de 0,2 aM.

smURFP é uma proteína auto-rotulável

A pequena Proteína Fluorescente Ultra-Vermelha (smURFP) é uma proteína que se auto-rotula. O substrato é fluorogênico, fluorescente quando conectado e extingue a carga fluorescente. A tag smURFP possui novas propriedades para o desenvolvimento de ferramentas.

A pequena proteína Ultra-Red Fluorescente (smURFP) é uma proteína auto-rotular como halo , SNAP -, e CLIP -Tags. A tag smURFP aceita um substrato de biliverdina modificado em um carboxilato com um ligante de polietilenoglicol (PEG) para a molécula de carga. Ao contrário das tags Halo-, SNAP- e CLIP que usam o substrato para anexar apenas covalentemente a molécula de carga, a biliverdina é fluorogênica e a fluorescência é ligada com a fixação covalente à tag smURFP para permitir o rastreamento de fluorescência em vermelho distante da molécula de carga em células vivas. A biliverdina também extingue a carga de fluoresceína para permitir a geração de imagens sem a remoção do substrato. Modificação biliverdina em um único carboxilato cria uma molécula neutra que passa do exterior e da membrana nuclear de mamíferos células .

Disponibilidade de cromóforo em células e camundongos

smURFP foi geneticamente fundido ao humano, lamina B1, para mostrar o envelope nuclear com fluorescência. A localização das alterações da proteína Lamin B1 durante as diferentes fases do ciclo celular.

Apesar de mostrar brilho biofísico comparável ao eGFP quando a proteína purificada foi normalizada, isso não foi visto em células vivas . Isso sugeriu que não havia cromóforo suficiente ( biliverdina ) dentro das células . A adição de biliverdina aumentou a fluorescência , mas smURFP com biliverdina não foi comparável a eGFP . A biliverdina tem dois carboxilatos em pH neutro e isso inibe a entrada celular. O éster dimetílico da biliverdina é um análogo mais hidrofóbico e atravessa facilmente a membrana celular . smURFP com éster dimetílico de biliverdina mostra fluorescência comparável a eGFP em células e é mais brilhante do que proteínas fluorescentes de fitocromo bacterianas .

smURFP expresso em cultura neuronal não mostra agregação em lisossomos, o que foi visto com a proteína fluorescente, mCherry .

Em ratinhos, smURFP fluorescência é visível em HT1080 de tumor de xenoenxertos sem exógeno biliverdina , mas a fluorescência é menos de coral vermelho derivada de proteínas fluorescentes , mCherry e mCardinal. Visível fluorescência não é sempre útil de fluorescência e proteínas fluorescentes deve ser sempre comparado com outros úteis, geneticamente codificados proteínas fluorescentes . A injeção intravenosa de biliverdina exógena ou éster dimetílico de biliverdina não aumenta a fluorescência de smURFP expressa em tumores após 1 a 24 horas. A espectrometria de massa mostrou que os grupos éster foram rapidamente removidos do éster dimetílico da biliverdina . A adição de 25 μM de biliverdina ou éster dimetílico de biliverdina aumentou dramaticamente a fluorescência de tumores excisados e smURFP está presente sem cromóforo . Mais pesquisas são necessárias para otimizar a disponibilidade de cromóforos em camundongos para obter fluorescência comparável ou maior do que as proteínas fluorescentes vermelhas derivadas de coral .

Adicionando cromóforo às células

Éster dimetílico de biliverdina , biliverdina e ficocianobilina estão comercialmente disponíveis na Frontier Scientific . Éster dimetílico de biliverdina , biliverdina ou ficocianobilina é dissolvido em DMSO a uma concentração de 5 mM. A solução é muito escura e pipete vigorosamente para garantir que tudo está dissolvido. O éster dimetílico da biliverdina não é solúvel em tampões comuns , incluindo solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina balanceada de Hank (HBSS). Adicionar 1-5 mM de éster dimetil biliverdina em meio ou tampão contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Adicione 25 μM de biliverdina (não como permeante de membrana) às células . A biliverdina não satura os locais smURFP e não atinge a intensidade máxima de fluorescência. O éster dimetílico de biliverdina deve ser usado para obter a intensidade máxima de fluorescência. Incubar smURFP com cromóforo pelo maior tempo possível para aumentar o acúmulo de proteína causado pela estabilidade aprimorada da proteína com cromóforo . Deixe o cromóforo por no mínimo 3 horas e 24 horas é recomendado. Remova o cromóforo , lave com mídia contendo FBS a 10% e a imagem em mídia sem vermelho de fenol ou tampão de imagem .

Biossensores smURFP geneticamente codificados

Far Red & Near Infrared FUCCI visualiza o nascimento de uma célula multinucleada, que é comum em muitas células cancerosas.

Sensor Kinase FRET . smURFP é um aceitador útil para muitas proteínas fluorescentes vermelhasdevido à sobreposição espectral. Uma proteína fluorescente vermelha projetada racionalmente, stagRFP, permite a criação mais fácil desensores FRET . stagRFP é um doador FRET útil para o aceitador vermelho distante smURFP e umrepórter ERK quinase FRET foi criado com uma resposta média de ~ 15%. O novo sensor permitiu a visualização simultânea de três quinases, Src , Akt , ERK , em uma única célula .

 

Imagem fluorescente do ciclo celular . O trabalho pioneiro de Atsushi Miyawaki e colegas de trabalho desenvolveu o indicador de ciclo celular baseado em ubiquitinação fluorescente ( FUCCI ), que permite imagens de fluorescência do ciclo celular. Originalmente, uma proteína fluorescente verde , mAG, foi fundida a hGem (1/110) e uma proteína fluorescente laranja (mKO 2 ) foi fundida a hCdt1 (30/120). Observe que essas fusões são fragmentos que contêm um sinal de localização nuclear e locais de ubiquitinação para degradação , mas não são proteínas funcionais. A proteína fluorescente verde é produzida durante a fase S, G 2 ou M e degradada durante a fase G 0 ou G 1 , enquanto a proteína fluorescente laranja é produzida durante a fase G 0 ou G 1 e destruída durante a fase S, G 2 ou fase M. Um FUCCI vermelho distante e infravermelho próximo foi desenvolvido usando uma proteína fluorescente derivada de cianobactérias (smURFP) e uma proteína fluorescente derivada de bacteriofitocromo ( filme encontrado neste link ).

smURFP (azul claro) expresso em E. coli .

Referências

links externos