DNA extracromossômico - Extrachromosomal DNA

DNA extracromossômico (abreviado ecDNA) é qualquer DNA encontrado fora dos cromossomos , dentro ou fora do núcleo de uma célula . A maior parte do DNA de um genoma individual é encontrada nos cromossomos contidos no núcleo. Existem várias formas de DNA extracromossômico e desempenham funções biológicas importantes, por exemplo, podem desempenhar um papel em doenças, como o ecDNA no câncer.

Em procariotos , o DNA extracromossômico não viral é encontrado principalmente em plasmídeos, enquanto que em eucariotos o DNA extracromossômico é encontrado principalmente em organelas . O DNA mitocondrial é a principal fonte desse DNA extracromossômico em eucariotos. O fato de essa organela conter seu próprio DNA apóia a hipótese de que as mitocôndrias se originaram de células bacterianas engolfadas por células eucarióticas ancestrais. O DNA extracromossômico é frequentemente usado na pesquisa de replicação porque são fáceis de identificar e isolar.

Embora o DNA circular extracromossômico (eccDNA) seja encontrado em células eucarióticas normais, o DNA extracromossômico ( ecDNA ) é uma entidade distinta que foi identificada nos núcleos das células cancerosas e demonstrou transportar muitas cópias de oncogenes controladores . ecDNA são considerados um mecanismo primário de amplificação de genes , resultando em muitas cópias de oncogenes driver e cânceres muito agressivos.  

O DNA extracromossômico no citoplasma mostrou ser estruturalmente diferente do DNA nuclear. O DNA citoplasmático é menos metilado do que o DNA encontrado dentro do núcleo. Também foi confirmado que as sequências de DNA citoplasmático eram diferentes do DNA nuclear de um mesmo organismo, mostrando que DNAs citoplasmáticos não são simplesmente fragmentos de DNA nuclear. Em células cancerosas, foi demonstrado que o ecDNA é isolado principalmente no núcleo (revisado em).

Além do DNA encontrado fora do núcleo nas células, a infecção de genomas virais também fornece um exemplo de DNA extracromossômico.

Procariota

plasmídeo pBR32 de E. coli

Embora os organismos procarióticos não possuam um núcleo ligado à membrana como os eucariotos, eles contêm uma região nucleóide na qual o cromossomo principal é encontrado. O DNA extracromossômico existe em procariotos fora da região nucleóide como plasmídeos circulares ou lineares . Os plasmídeos bacterianos são sequências tipicamente curtas, consistindo em segmentos de 1 quilobase (kb) a algumas centenas de kb, e contêm uma origem de replicação que permite que o plasmídeo se replique independentemente do cromossomo bacteriano. O número total de um plasmídeo específico dentro de uma célula é referido como o número de cópias e pode variar de apenas duas cópias por célula a várias centenas de cópias por célula. Os plasmídeos bacterianos circulares são classificados de acordo com as funções especiais que os genes codificados no plasmídeo fornecem. Os plasmídeos de fertilidade, ou plasmídeos f, permitem que a conjugação ocorra, enquanto os plasmídeos de resistência, ou plasmídeos r, contêm genes que transmitem resistência a uma variedade de antibióticos diferentes, como ampicilina e tetraciclina. Também existem plasmídeos de virulência que contêm os elementos genéticos necessários para que as bactérias se tornem patogênicas, bem como plasmídeos degradativos que abrigam os genes que permitem que as bactérias degradem uma variedade de substâncias, como compostos aromáticos e xenobióticos . Os plasmídeos bacterianos também podem atuar na produção de pigmentos, fixação de nitrogênio e resistência a metais pesados ​​nas bactérias que os possuem.

Plasmídeos circulares de ocorrência natural podem ser modificados para conter vários genes de resistência e vários locais de restrição exclusivos , tornando-os ferramentas valiosas como vetores de clonagem em aplicações de biotecnologia. Plasmídeos bacterianos circulares também são a base para a produção de vacinas de DNA . As vacinas de DNA de plasmídeo são geneticamente modificadas para conter um gene que codifica um antígeno ou uma proteína produzida por um vírus patogênico, bactéria ou outros parasitas. Uma vez entregues ao hospedeiro, os produtos dos genes do plasmídeo irão estimular a resposta imune inata e a resposta imune adaptativa do hospedeiro. Os plasmídeos são frequentemente revestidos com algum tipo de adjuvante antes da entrega para aumentar a resposta imune do hospedeiro.

Plasmídeos bacterianos lineares foram identificados em várias espécies de bactérias espiroquetas , incluindo membros do gênero Borrelia (ao qual pertence o patógeno responsável pela doença de Lyme ), várias espécies de bactérias gram positivas do solo do gênero Streptomyces e nas espécies gram negativas Thiobacillus versutus , uma bactéria que oxida o enxofre. Os plasmídeos lineares de procariotos são encontrados contendo uma alça em gancho ou uma proteína ligada covalentemente ligada às extremidades teloméricas da molécula de DNA. As alças em gancho ricas em adenina-timina da bactéria Borrelia variam em tamanho de 5 pares de quilobases (kb) a mais de 200 kb e contêm os genes responsáveis ​​pela produção de um grupo de proteínas de superfície principais, ou antígenos, nas bactérias que permitem sua evasão a resposta imune de seu hospedeiro infectado. Os plasmídeos lineares que contêm uma proteína que foi covalentemente ligada à extremidade 5 'das cadeias de DNA são conhecidos como invertrons e podem variar em tamanho de 9 kb a mais de 600 kb consistindo em repetições terminais invertidas . Os plasmídeos lineares com uma proteína ligada covalentemente podem auxiliar na conjugação bacteriana e integração dos plasmídeos no genoma. Esses tipos de plasmídeos lineares representam a maior classe de DNA extracromossômico, pois não estão apenas presentes em certas células bacterianas, mas todas as moléculas de DNA extracromossômico linear encontradas em células eucarióticas também assumem essa estrutura invertron com uma proteína ligada à extremidade 5 '.

Os longos " borgs " lineares que co-ocorrem com uma espécie de archaeon - que pode hospedá-los e compartilhar muitos de seus genes - podem ser uma forma desconhecida de estruturas extracromossômicas de DNA.

Eucariótica

Mitocondrial

DNA mitocondrial humano mostrando os 37 genes

As mitocôndrias presentes nas células eucarióticas contêm múltiplas cópias de DNA mitocondrial, conhecidas como mtDNA, que está alojado dentro da matriz mitocondrial . Em animais multicelulares, incluindo humanos, o cromossomo mtDNA circular contém 13 genes que codificam proteínas que fazem parte da cadeia de transporte de elétrons e 24 genes que produzem o RNA necessário para a produção de proteínas mitocondriais; esses genes são divididos em 2 genes de rRNA e 22 genes de tRNA . O tamanho de um plasmídeo de mtDNA animal é de aproximadamente 16,6 kb e, embora contenha genes para a síntese de tRNA e mRNA, as proteínas produzidas como resultado de genes nucleares ainda são necessárias para que o mtDNA se replique ou para que as proteínas mitocondriais sejam traduzidas. Há apenas uma região do cromossomo mitocondrial que não contém uma sequência codificadora e que é a região de 1 kb conhecida como D-loop à qual as proteínas reguladoras nucleares se ligam. O número de moléculas de mtDNA por mitocôndria varia de espécie para espécie, bem como entre células com diferentes demandas de energia. Por exemplo, as células musculares e hepáticas contêm mais cópias de mtDNA por mitocôndria do que as células sanguíneas e cutâneas. Devido à proximidade da cadeia de transporte de elétrons dentro da membrana mitocondrial interna e à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), e devido ao fato de que a molécula de mtDNA não está ligada ou protegida por histonas, o mtDNA é mais suscetível ao DNA danos do que o DNA nuclear. Nos casos em que ocorre dano ao mtDNA, o DNA pode ser reparado por vias de reparo de excisão de base ou a molécula de mtDNA danificada é destruída (sem causar danos à mitocôndria, uma vez que há várias cópias de mtDNA por mitocôndria).

O código genético padrão pelo qual os genes nucleares são traduzidos é universal, o que significa que cada sequência de 3 bases do DNA codifica o mesmo aminoácido, independentemente da espécie de onde vem o DNA. No entanto, essa natureza universal do código não é o caso do DNA mitocondrial encontrado em fungos, animais, protistas e plantas. Enquanto a maioria das sequências de 3 bases no mtDNA desses organismos codificam para os mesmos aminoácidos do código genético nuclear, existem algumas sequências de mtDNA que codificam para aminoácidos diferentes daqueles de suas contrapartes do DNA nuclear.

Acredita-se que as diferenças de codificação sejam o resultado de modificações químicas nos RNAs de transferência que interagem com os RNAs mensageiros produzidos como resultado da transcrição das sequências de mtDNA.

Cloroplasto

Os cloroplastos eucarióticos , assim como os outros plastídios vegetais , também contêm moléculas de DNA extracromossômicas. A maioria dos cloroplastos aloja todo o seu material genético em um único cromossomo anelado, no entanto, em algumas espécies há evidências de múltiplos plasmídeos menores com anéis . Uma teoria recente que questiona o modelo padrão atual do DNA do cloroplasto em forma de anel (cpDNA) sugere que o cpDNA pode mais comumente assumir uma forma linear. Uma única molécula de cpDNA pode conter de 100-200 genes e varia em tamanho de espécie para espécie. O tamanho do cpDNA em plantas superiores é de cerca de 120–160 kb. Os genes encontrados no cpDNA codificam para mRNAs que são responsáveis ​​por produzir os componentes necessários da via fotossintética , bem como codificar para tRNAs, rRNAs , subunidades de RNA polimerase e subunidades de proteínas ribossômicas . Como o mtDNA, o cpDNA não é totalmente autônomo e depende de produtos de genes nucleares para a replicação e produção de proteínas do cloroplasto. Os cloroplastos contêm múltiplas cópias de cpDNA e o número pode variar não apenas de espécie para espécie ou tipo de célula para tipo de célula, mas também dentro de uma única célula, dependendo da idade e do estágio de desenvolvimento da célula. Por exemplo, o conteúdo de cpDNA nos cloroplastos de células jovens, durante os estágios iniciais de desenvolvimento em que os cloroplastos estão na forma de proplastídeos indistintos, são muito maiores do que aqueles presentes quando a célula amadurece e se expande, contendo plastídeos totalmente maduros.

Circular

O DNA extracromossômico circular (eccDNA) está presente em todas as células eucarióticas , geralmente são derivados do DNA genômico e consistem em sequências repetitivas de DNA encontradas nas regiões codificantes e não codificantes dos cromossomos. O tamanho do EccDNA pode variar de menos de 2.000 pares de bases a mais de 20.000 pares de bases. Nas plantas, o eccDNA contém sequências repetidas semelhantes às encontradas nas regiões centroméricas dos cromossomos e no DNA repetitivo do satélite. Em animais, foi demonstrado que as moléculas de eccDNA contêm sequências repetitivas que são vistas no DNA satélite , DNA ribossômico 5S e DNA telômero . Certos organismos, como a levedura, dependem da replicação do DNA cromossômico para produzir eccDNA, enquanto a formação do eccDNA pode ocorrer em outros organismos, como mamíferos, independentemente do processo de replicação. A função do eccDNA não foi amplamente estudada, mas foi proposto que a produção de elementos do eccDNA a partir de sequências de DNA genômico aumentam a plasticidade do genoma eucariótico e podem influenciar a estabilidade do genoma, o envelhecimento celular e a evolução dos cromossomos.

Um tipo distinto de DNA extracromossômico, denominado ecDNA , é comumente observado em células cancerosas humanas. O ecDNA encontrado nas células cancerosas contém um ou mais genes que conferem uma vantagem seletiva. ecDNA são muito maiores do que eccDNA e são visíveis por microscopia de luz. O ecDNA em cânceres geralmente varia em tamanho de 1-3 MB e além. Grandes moléculas de ecDNA foram encontradas nos núcleos de células cancerosas humanas e demonstraram transportar muitas cópias de oncogenes controladores , que são transcritos em células tumorais. Com base nessas evidências, acredita-se que o ecDNA contribua para o crescimento do câncer.

Existem ferramentas especializadas que permitem a identificação do ecDNA, como

• software desenvolvido por Paul Mischel e Vineet Bafna que permite a identificação do ecDNA em imagens microscópicas
• "Circle-Seq, um método para isolar fisicamente o ecDNA das células, removendo qualquer DNA linear remanescente com enzimas e sequenciando o DNA circular que permanece", desenvolvido por Birgitte Regenberg e sua equipe na Universidade de Copenhagen.

Viral

O DNA viral é um exemplo de DNA extracromossômico. Compreender os genomas virais é muito importante para compreender a evolução e mutação do vírus. Alguns vírus, como o HIV e os vírus oncogênicos , incorporam seu próprio DNA ao genoma da célula hospedeira. Os genomas virais podem ser constituídos por DNA de fita simples ( ssDNA ), DNA de fita dupla ( dsDNA ) e podem ser encontrados nas formas linear e circular.

Um exemplo de infecção de um vírus que se constitui como DNA extracromossômico é o papilomavírus humano ( HPV ). O genoma do DNA do HPV passa por três estágios distintos de replicação: estabelecimento, manutenção e amplificação. O HPV infecta as células epiteliais do trato anogenital e da cavidade oral. Normalmente, o HPV é detectado e eliminado pelo sistema imunológico. O reconhecimento do DNA viral é uma parte importante das respostas imunes. Para que esse vírus persista, o genoma circular deve ser replicado e herdado durante a divisão celular.

Reconhecimento por célula hospedeira

As células podem reconhecer DNA citoplasmático estranho. Compreender as vias de reconhecimento tem implicações para a prevenção e o tratamento de doenças. As células têm sensores que podem reconhecer especificamente o DNA viral, como a via do receptor Toll-like (TLR).

A Toll Pathway foi reconhecida, primeiro em insetos, como uma via que permite que certos tipos de células atuem como sensores capazes de detectar uma variedade de genomas bacterianos ou virais e PAMPS ( padrões moleculares associados a patógenos ). PAMPs são conhecidos por serem potentes ativadores da sinalização imune inata . Existem aproximadamente 10 receptores semelhantes a Toll humanos (TLRs). Diferentes TLRs em humanos detectam diferentes PAMPS: lipopolissacarídeos por TLR4 , dsRNA viral por TLR3 , ssRNA viral por TLR7 / TLR8 , DNA viral ou bacteriano não metilado por TLR9 . O TLR9 evoluiu para detectar o DNA CpG comumente encontrado em bactérias e vírus e para iniciar a produção de IFN (interferons tipo I) e outras citocinas .

Herança

Herança mitocondrial em humanos: o mtDNA e suas mutações são transmitidos pela mãe.

A herança do DNA extracromossômico difere da herança do DNA nuclear encontrado nos cromossomos. Ao contrário dos cromossomos, o ecDNA não contém centrômeros e, portanto, exibe um padrão de herança não mendeliano que dá origem a populações de células heterogêneas. Em humanos, praticamente todo o citoplasma é herdado do óvulo da mãe. Por esse motivo, o DNA da organela, incluindo o mtDNA, é herdado da mãe. Mutações no mtDNA ou em outro DNA citoplasmático também serão herdadas da mãe. Essa herança uniparental é um exemplo de herança não mendeliana . As plantas também apresentam herança uniparental de mtDNA. A maioria das plantas herda o mtDNA pela mãe, com uma exceção observada sendo a sequóia vermelha Sequoia sempervirens, que herda o mtDNA pela mãe .

Existem duas teorias pelas quais o mtDNA paterno raramente é transmitido à prole. Um é simplesmente o fato de que o mtDNA paterno está em uma concentração tão baixa do que o mtDNA materno e, portanto, não é detectável na prole. Uma segunda teoria, mais complexa, envolve a digestão do mtDNA paterno para prevenir sua herança. Teoriza-se que a herança uniparental do mtDNA, que apresenta alta taxa de mutação , pode ser um mecanismo para manter a homoplasmia do DNA citoplasmático.

Significado clínico

Às vezes chamados de EEs, elementos extracromossômicos, foram associados à instabilidade genômica em eucariotos. Pequenos DNAs polidispersos (spcDNAs), um tipo de eccDNA, são comumente encontrados em conjunto com a instabilidade do genoma. SpcDNAs são derivados de sequências repetitivas, como DNA satélite , elementos de DNA semelhantes a retrovírus e elementos transponíveis no genoma. Eles são considerados produtos de rearranjos de genes.

O DNA extracromossômico ( ecDNA ) encontrado no câncer tem sido historicamente conhecido como cromossomos de minuto duplo (DMs), que se apresentam como corpos de cromatina emparelhados sob microscopia de luz . Os cromossomos de minuto duplo representam cerca de 30% do espectro do ecDNA contendo câncer, incluindo corpos únicos e foram encontrados para conter conteúdo de gene idêntico a corpos únicos. A notação ecDNA abrange todas as formas do grande DNA extracromossômico contendo oncogenes, encontrado nas células cancerosas. Este tipo de ecDNA é comumente visto em células cancerosas de várias histologias, mas virtualmente nunca em células normais. Acredita-se que o ecDNA seja produzido por meio de quebras de fita dupla nos cromossomos ou replicação excessiva do DNA em um organismo. Estudos mostram que em casos de câncer e outras instabilidades genômicas, níveis mais elevados de EEs podem ser observados.

O DNA mitocondrial pode desempenhar um papel no início da doença de várias maneiras. As mutações pontuais em alternativos ou arranjos de genes de mtDNA têm sido associadas a várias doenças que afectam o coração, sistema nervoso central , sistema endócrino , tracto gastrointestinal, olho e rim. A perda da quantidade de mtDNA presente nas mitocôndrias pode levar a todo um subconjunto de doenças conhecidas como síndromes de depleção mitocondrial (MDDs) que afetam o fígado, sistemas nervosos central e periférico , músculo liso e audição em humanos. Tem havido resultados mistos, e às vezes conflitantes, em estudos que tentam vincular o número de cópias do mtDNA ao risco de desenvolver certos tipos de câncer. Foram realizados estudos que mostram uma associação entre os níveis aumentados e diminuídos de mtDNA e o risco aumentado de desenvolver câncer de mama . Uma associação positiva entre níveis aumentados de mtDNA e um risco aumentado de desenvolver tumores renais foi observada, mas não parece haver uma ligação entre os níveis de mtDNA e o desenvolvimento de câncer de estômago .

O DNA extracromossômico é encontrado em Apicomplexa , que é um grupo de protozoários . O parasita da malária (gênero Plasmodium), o patógeno relacionado à AIDS ( Taxoplasma e Cryptosporidium ) são ambos membros do grupo Apicomplexa. DNA mitocondrial (mtDNA) foi encontrado no parasita da malária. Existem duas formas de DNA extracromossômico encontradas nos parasitas da malária. Um deles é o DNA linear de 6 kb e o segundo é o DNA circular de 35 kb. Essas moléculas de DNA foram pesquisadas como potenciais locais alvo de nucleotídeos para antibióticos .

Papel do ecDNA no câncer

A amplificação do gene está entre os mecanismos mais comuns de ativação do oncogene . As amplificações gênicas no câncer geralmente ocorrem em elementos circulares extracromossômicos. Uma das funções primárias do ecDNA no câncer é permitir que o tumor atinja rapidamente um grande número de cópias , ao mesmo tempo que promove uma heterogeneidade genética rápida e massiva de célula a célula . Os oncogenes mais comumente amplificados no câncer são encontrados no ecDNA e mostraram ser altamente dinâmicos, reintegrando-se em cromossomos não nativos como regiões de coloração homogêneas (HSRs) e alterando o número de cópias e a composição em resposta a vários tratamentos com drogas.

A forma circular do ecDNA difere da estrutura linear do DNA cromossômico de maneiras significativas que influenciam a patogênese do câncer . Oncogenes codificados no ecDNA têm produção transcricional maciça, ocupando o primeiro lugar entre os 1% dos genes em todo o transcriptoma . Em contraste com plasmídeos bacterianos ou DNA mitocondrial, ecDNA são cromatinizados, contendo altos níveis de marcas ativas de histonas, mas uma escassez de marcas repressivas de histonas. A arquitetura da cromatina do ecDNA carece da compactação de ordem superior que está presente no DNA cromossômico e está entre os DNA mais acessíveis em todo o genoma do câncer.

Referências

Leitura adicional