Citrulinação - Citrullination
Citrulinação ou deiminação é a conversão do aminoácido arginina em uma proteína no aminoácido citrulina . Citrulina não é um dos 20 aminoácidos padrão codificados pelo DNA no código genético . Em vez disso, é o resultado de uma modificação pós-tradução . A citrulinação é diferente da formação do aminoácido livre citrulina como parte do ciclo da ureia ou como subproduto de enzimas da família da óxido nítrico sintase .
Enzimas chamadas arginina desiminases (ADIs) catalisam a deiminação de arginina livre, enquanto as proteínas arginina desiminases ou peptidilarginina desiminases (PADs) substituem o grupo cetimina primário (> C = NH) por um grupo cetona (> C = O). A arginina é carregada positivamente em um pH neutro, enquanto a citrulina não tem carga líquida. Isso aumenta a hidrofobicidade da proteína, o que pode levar a mudanças no enovelamento da proteína , afetando a estrutura e função.
O sistema imunológico pode atacar proteínas citrulinadas, levando a doenças autoimunes, como artrite reumatóide (AR) e esclerose múltipla (EM). A fibrina e o fibrinogênio podem ser locais favorecidos para a deiminação de arginina nas articulações reumatóides. Teste para presença de anticorpos anti-proteína citrulinada (ACP) são altamente específicos (88-96%) para artrite reumatóide, quase tão sensível quanto o fator reumatoide (70-78%) para o diagnóstico de AR, e são detectáveis mesmo antes do início de doença clínica.
A vimentina citrulinada pode ser um autoantígeno na AR e em outras doenças autoimunes, e é usada para estudar a AR. Além disso, os anticorpos contra a vimentina citrulinada mutada (MCV) podem ser úteis para monitorar os efeitos da terapia de AR. Um sistema ELISA utiliza vimentina citrulinada geneticamente modificada (MCV), uma isoforma natural de vimentina para melhorar o desempenho do teste.
Na reação da arginina à citrulina, um dos átomos terminais de nitrogênio da cadeia lateral da arginina é substituído por um oxigênio . Assim, a carga positiva da arginina (em pH fisiológico) é removida, alterando a estrutura terciária da proteína . A reação usa uma molécula de água e produz amônia como subproduto:
Subtipos PAD
PADs são encontrados em cordados, mas não em animais inferiores. Em mamíferos, cinco isotipos PAD - PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 e PAD6 - foram encontrados. PAD5 foi pensado para ser um isótipo único em humanos, no entanto, mostrou ser homólogo ao PAD4. Esses isotipos diferem em termos de suas distribuições de tecidos e celulares.
A expressão de PAD1 foi detectada na epiderme e no útero e atua na citrulinação da queratina e da filagrina , componentes-chave dos queratinócitos .
O PAD2 é expresso em alto nível no sistema nervoso central (SNC), incluindo o olho e o cérebro, bem como o músculo esquelético e o baço. Transcrições de PAD foram encontradas nos olhos de camundongos C57BL6 / J já no dia embrionário 14.5. PAD2 também demonstrou interagir com a vimentina no músculo esquelético e macrófagos, causando a desmontagem dos filamentos, sugerindo um papel na apoptose .
Um dos substratos alvo de PAD2 é a proteína básica de mielina (MBP). Na retina normal , a deiminação é encontrada em quase todas as camadas da retina, incluindo os fotorreceptores . A eliminação também foi relatada em células neuronais, como astrócitos , microglia e oligodendrócitos , células de Schwann e neurônios . A metilação e fosforilação da MBP são ativas durante o processo de mielinogênese . No desenvolvimento inicial do SNC do embrião, a deiminação de MBP desempenha um papel importante na montagem da mielina. Em adultos, a deiminação de MBP é encontrada em doenças de desmielinização, como a esclerose múltipla. O MBP pode afetar diferentes tipos de células em cada caso.
A expressão de PAD3 foi associada à modificação da lã de ovelha. A citrulinação da trico - hialina permite que ela se ligue e reticule os filamentos de queratina, direcionando o crescimento da fibra de lã.
PAD4 regula a expressão gênica por meio de modificações de histonas . O DNA é envolvido em torno das histonas, e as proteínas histonas podem controlar a expressão do DNA quando grupos químicos são adicionados e removidos. Esse processo é conhecido como processamento pós-tradução ou modificação pós-tradução, porque ocorre na proteína depois que o DNA é traduzido. O papel do processamento pós-tradução na regulação gênica é o assunto do crescente campo de estudo, a epigenética . Um mecanismo de modificação é a metilação . Um grupo metil (CH 3 ) se liga a uma arginina na proteína histona, alterando a ligação do DNA à histona e permitindo que a transcrição ocorra. Quando o PAD converte arginina em citrulina em uma histona, ele bloqueia a metilação posterior da histona, inibindo a transcrição. O principal isótipo para isso é PAD4, que deiminina argininas e / ou argininas monometiladas nas histonas 3 e 4, desligando os efeitos da metilação da arginina.
Doenças autoimunes
Na artrite reumatóide e em outras doenças autoimunes, como artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico e síndrome de Sjögren, os autoanticorpos costumam atacar as proteínas citrulinadas. A presença de anticorpo anti-proteína citrulinada é um teste padrão para artrite reumatoide e está associada a doenças mais graves. Proteínas citrulinadas também são encontradas nos restos celulares que acompanham a destruição das células na doença de Alzheimer e após fumar cigarros. Portanto, a citrulinação parece fazer parte do mecanismo que estimula o sistema imunológico nas doenças autoimunes. No entanto, as proteínas citrulinadas também podem ser encontradas na mucosa do cólon saudável .
O primeiro livro didático abrangente sobre a deiminação foi publicado em 2014.
Detecção de peptídeos citrulinados e proteínas
Peptídeos e proteínas citrulinados podem ser detectados usando anticorpos direcionados aos resíduos citrulinados, ou detectados usando tecnologias de proteômica baseadas em espectrometria de massa . A citrulinação da arginina resulta em um aumento de massa monoisotópico de +0,984016 Da, que pode ser medido com espectrometria de massa . O deslocamento de massa está próximo da diferença de massa entre os diferentes isótopos de peptídeo de +1,008665, que pode ser confundido com um peptídeo citrulinado, especialmente em instrumentos de baixa resolução. No entanto, esse é um problema menor com os modernos espectrômetros de massa de alta resolução / alta precisão. Além disso, a mudança de massa é idêntica à mudança de massa causada pela desamidação do aminoácido asparagina ou da cadeia lateral da glutamina , que são modificações comuns.
Os resíduos de citrulina podem ser modificados quimicamente com butanediona ou por biotinilação antes da análise, levando a uma mudança de massa diferente, e esta estratégia tem sido usada com sucesso para facilitar a identificação por espectrometria de massa .
Outra abordagem é utilizar a perda neutra de ácido isociânico (HNCO) de resíduos de citrulina quando submetidos à fragmentação de dissociação induzida por colisão de baixa energia em espectrômetros de massa. A perda causa um deslocamento de massa de -43,0058 Da, que pode ser utilizado por espectrômetros de massa para selecionar predominantemente peptídeos citrulinados para fragmentação (sequenciamento).
Finalmente, a perda de carga positiva em pH fisiológico causada pela citrulinação pode ser utilizada. Antes da análise proteômica de baixo para cima , as proteínas são enzimaticamente clivadas em peptídeos. Normalmente é usada a protease tripsina , que cliva após os resíduos de arginina e lisina carregados positivamente . No entanto, a tripsina é incapaz de clivar após um resíduo de citrulina que é neutro. Uma clivagem perdida após um resíduo de citrulina juntamente com o deslocamento de massa correto pode ser usado como um marcador específico e sensível para citrulinação, e a estratégia é compatível com fluxos de trabalho proteômicos padrão de baixo para cima .