Pinça de tensão - Voltage clamp

O grampo de tensão opera por feedback negativo . O amplificador de potencial de membrana mede a tensão de membrana e envia a saída para o amplificador de feedback; isso subtrai a tensão da membrana da tensão de comando, que recebe do gerador de sinal. Este sinal é amplificado e a saída é enviada para o axônio por meio do eletrodo de passagem de corrente .

A pinça de voltagem é um método experimental usado por eletrofisiologistas para medir as correntes de íons através das membranas de células excitáveis, como os neurônios , enquanto mantém a voltagem da membrana em um nível definido. Um grampo de voltagem básica medirá iterativamente o potencial da membrana e, em seguida, alterará o potencial da membrana (voltagem) para um valor desejado adicionando a corrente necessária. Isso "fixa" a membrana da célula em uma voltagem constante desejada, permitindo que a pinça de voltagem registre quais correntes são fornecidas. Como as correntes aplicadas à célula devem ser iguais (e opostas à carga ) à corrente que atravessa a membrana da célula na tensão definida, as correntes registradas indicam como a célula reage às mudanças no potencial da membrana. As membranas celulares das células excitáveis ​​contêm muitos tipos diferentes de canais iônicos , alguns dos quais dependentes de voltagem . O grampo de voltagem permite que a voltagem da membrana seja manipulada independentemente das correntes iônicas, permitindo que as relações corrente-voltagem dos canais da membrana sejam estudadas.

História

O conceito do grampo de tensão é atribuído a Kenneth Cole e George Marmont na primavera de 1947. Eles inseriram um eletrodo interno no axônio gigante de uma lula e começaram a aplicar uma corrente. Cole descobriu que era possível usar dois eletrodos e um circuito de feedback para manter o potencial de membrana da célula em um nível definido pelo experimentador.

Cole desenvolveu a técnica de pinça de voltagem antes da era dos microeletrodos , então seus dois eletrodos consistiam em fios finos enrolados em uma haste isolante . Como esse tipo de eletrodo podia ser inserido apenas nas células maiores, os primeiros experimentos eletrofisiológicos foram conduzidos quase exclusivamente em axônios de lula .

Uma foto pessoal de Kenneth Cole, dada ao Dr. J. Walter Woodbury

As lulas esguicham jatos de água quando precisam se mover rapidamente, como quando escapam de um predador. Para fazer esse escape o mais rápido possível, eles têm um axônio que pode atingir 1 mm de diâmetro (os sinais se propagam mais rapidamente por grandes axônios). O axônio gigante da lula foi a primeira preparação que poderia ser usada para fixar a tensão em uma corrente transmembrana, e foi a base dos experimentos pioneiros de Hodgkin e Huxley sobre as propriedades do potencial de ação.

Alan Hodgkin percebeu que, para entender o fluxo de íons através da membrana, era necessário eliminar as diferenças no potencial da membrana. Usando experimentos com o grampo de tensão, Hodgkin e Andrew Huxley publicaram 5 artigos no verão de 1952 descrevendo como as correntes iônicas dão origem ao potencial de ação . O artigo final propôs o modelo de Hodgkin-Huxley que descreve matematicamente o potencial de ação. O uso de pinças de voltagem em seus experimentos para estudar e modelar o potencial de ação em detalhes lançou as bases para a eletrofisiologia ; pelo qual eles dividiram o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1963 .

Técnica

O grampo de tensão é um gerador de corrente. A tensão transmembrana é registrada por meio de um "eletrodo de tensão", em relação ao solo , e um "eletrodo de corrente" passa a corrente para a célula. O experimentador define uma "tensão de retenção", ou "potencial de comando", e o grampo de tensão usa feedback negativo para manter a célula nesta tensão. Os eletrodos são conectados a um amplificador, que mede o potencial de membrana e alimenta o sinal em um amplificador de feedback . Este amplificador também obtém uma entrada do gerador de sinal que determina o potencial de comando e subtrai o potencial de membrana do potencial de comando ( _comando V - V _m ), amplia qualquer diferença e envia uma saída para o eletrodo de corrente. Sempre que a célula se desvia da tensão de retenção, o amplificador operacional gera um "sinal de erro", que é a diferença entre o potencial de comando e a tensão real da célula. O circuito de feedback passa a corrente para a célula para reduzir o sinal de erro a zero. Assim, o circuito da pinça produz uma corrente igual e oposta à corrente iônica.

Variações da técnica de fixação de tensão

Pinça de tensão de dois eletrodos usando microeletrodos

Pinça de tensão de dois eletrodos

A técnica de pinça de voltagem de dois eletrodos (TEVC) é usada para estudar propriedades de proteínas de membrana, especialmente canais de íons. Os pesquisadores usam esse método mais comumente para investigar estruturas de membrana expressas em oócitos de Xenopus . O grande tamanho desses oócitos permite fácil manuseio e manipulação.

O método TEVC utiliza duas pipetas de baixa resistência, uma de detecção de tensão e a outra de injeção de corrente. Os microeletrodos são preenchidos com solução condutiva e inseridos na célula para controlar artificialmente o potencial de membrana. A membrana atua como um dielétrico e também como um resistor , enquanto os fluidos em ambos os lados da membrana funcionam como capacitores . Os microeletrodos comparam o potencial da membrana contra uma voltagem de comando, dando uma reprodução precisa das correntes que fluem através da membrana. As leituras atuais podem ser usadas para analisar a resposta elétrica da célula a diferentes aplicações.

Esta técnica é preferida em relação ao grampo de microeletrodo único ou outras técnicas de grampo de tensão quando as condições exigem a resolução de grandes correntes. A alta capacidade de passagem de corrente do grampo de dois eletrodos torna possível fixar grandes correntes que são impossíveis de controlar com técnicas de patch de um único eletrodo . O sistema de dois eletrodos também é desejável por seu rápido tempo de fixação da garra e baixo ruído. No entanto, o uso de TEVC é limitado em relação ao tamanho da célula. É eficaz em oócitos de maior diâmetro, mas é mais difícil de usar com células pequenas. Além disso, o método TEVC é limitado porque o transmissor de corrente deve estar contido na pipeta. Não é possível manipular o líquido intracelular durante o clampeamento, o que é possível usando técnicas de patch clamp. Outra desvantagem envolve problemas de "grampo de espaço". O grampo de voltagem de Cole usava um longo fio que prendia o axônio da lula uniformemente ao longo de todo o seu comprimento. Microeletrodos TEVC podem fornecer apenas uma fonte de ponto espacial de corrente que pode não afetar uniformemente todas as partes de uma célula de formato irregular.

Pinça de voltagem de célula dupla

A técnica de grampo de tensão de célula dupla é uma variação especializada do grampo de tensão de dois eletrodos e só é usada no estudo de canais de junção de lacuna . Gap junctions são poros que ligam diretamente duas células através das quais íons e pequenas moléculas fluem livremente. Quando duas células nas quais as proteínas de junção de lacuna, normalmente conexinas ou inexinas , são expressas, seja endogenamente ou por meio de injeção de mRNA , um canal de junção se forma entre as células. Uma vez que duas células estão presentes no sistema, dois conjuntos de eletrodos são usados. Um eletrodo de registro e um eletrodo de injeção de corrente são inseridos em cada célula, e cada célula é fixada individualmente (cada conjunto de eletrodos é anexado a um aparelho separado e a integração de dados é realizada por computador). Para registrar a condutância juncional , a corrente é variada na primeira célula, enquanto o eletrodo de registro na segunda célula registra quaisquer mudanças em V _{m apenas} para a segunda célula. (O processo pode ser revertido com o estímulo ocorrendo na segunda célula e o registro ocorrendo na primeira célula.) Uma vez que nenhuma variação na corrente está sendo induzida pelo eletrodo na célula registrada, qualquer mudança na voltagem deve ser induzida pelo cruzamento da corrente para dentro a célula gravada, através dos canais de junção de lacuna, da célula em que a corrente foi variada.

Pinça de tensão de eletrodo único

Esta categoria descreve um conjunto de técnicas nas quais um eletrodo é usado para o grampo de tensão. A técnica de pinça contínua de eletrodo único (SEVC-c) é frequentemente usada com a gravação de patch-clamp. A técnica de pinça de tensão de eletrodo único descontínuo (SEVC-d) é usada com registro intracelular penetrante. Este único eletrodo realiza as funções de injeção de corrente e registro de tensão.

Pinça contínua de eletrodo único (SEVC-c)

A técnica "patch-clamp" permite o estudo de canais iônicos individuais. Ele usa um eletrodo com uma ponta relativamente grande (> 1 micrômetro) que tem uma superfície lisa (em vez de uma ponta afiada). Este é um "eletrodo patch-clamp" (diferente de um "eletrodo afiado" usado para empalar células). Este eletrodo é pressionado contra a membrana da célula e a sucção é aplicada para puxar a membrana da célula para dentro da ponta do eletrodo. A sucção faz com que a célula forme uma vedação hermética com o eletrodo (uma "vedação gigaohm", pois a resistência é superior a um gigaohm ).

O SEV-c tem a vantagem de poder gravar de pequenas células que seriam impossíveis de empalar com dois eletrodos. Contudo:

1. Microeletrodos são condutores imperfeitos; em geral, eles têm uma resistência de mais de um milhão de ohms . Eles retificam (ou seja, mudam sua resistência com voltagem, muitas vezes de maneira irregular), às vezes têm resistência instável se obstruídos pelo conteúdo da célula. Assim, eles não registrarão fielmente a voltagem da célula, especialmente quando ela está mudando rapidamente, nem farão a passagem de corrente fielmente.
2. Erros de tensão e corrente: o circuito SEV-c não mede realmente a tensão da célula que está sendo fixada (como faz um grampo de dois eletrodos). O amplificador patch-clamp é como um grampo de dois eletrodos, exceto que os circuitos de medição de tensão e passagem de corrente são conectados (no grampo de dois eletrodos, eles são conectados através da célula ). O eletrodo é conectado a um fio que faz contato com o loop de corrente / tensão dentro do amplificador. Assim, o eletrodo tem apenas uma influência indireta no circuito de feedback. O amplificador lê apenas a voltagem na parte superior do eletrodo e realimenta a corrente para compensar. Mas, se o eletrodo é um condutor imperfeito, o circuito da pinça tem apenas uma visão distorcida do potencial da membrana. Da mesma forma, quando o circuito devolve a corrente para compensar essa tensão (distorcida), a corrente será distorcida pelo eletrodo antes de chegar à célula. Para compensar isso, o eletrofisiologista usa o eletrodo de menor resistência possível, certifica-se de que as características do eletrodo não mudam durante um experimento (para que os erros sejam constantes) e evita registrar correntes com cinética provavelmente muito rápida para o grampo siga com precisão. A precisão do SEV-c aumenta quanto mais lenta e menor forem as mudanças de tensão que ele está tentando travar.
3. Erros de resistência em série: As correntes passadas para a célula devem ir para o aterramento para completar o circuito. As tensões são registradas pelo amplificador em relação ao terra. Quando uma célula é fixada em seu potencial de repouso natural , não há problema; o grampo não está passando a corrente e a tensão está sendo gerada apenas pela célula. Mas, ao fixar em um potencial diferente, os erros de resistência em série tornam-se uma preocupação; a célula passará corrente através de sua membrana em uma tentativa de retornar ao seu potencial de repouso natural. O amplificador de grampo se opõe a isso passando a corrente para manter o potencial de retenção. Surge um problema porque o eletrodo está entre o amplificador e a célula; ou seja, o eletrodo está em série com o resistor que é a membrana da célula. Assim, ao passar a corrente pelo eletrodo e pela célula, a Lei de Ohm nos diz que isso fará com que uma voltagem se forme na resistência da célula e do eletrodo. Como esses resistores estão em série, as quedas de tensão aumentarão. Se o eletrodo e a membrana celular tiverem resistências iguais (o que geralmente não acontece), e se o experimentador comandar uma mudança de 40mV do potencial de repouso, o amplificador passará corrente suficiente até ler que atingiu essa mudança de 40mV. No entanto, neste exemplo, metade dessa queda de tensão ocorre no eletrodo. O experimentador pensa que mudou a tensão da célula em 40 mV, mas apenas em 20 mV. A diferença é o "erro de resistência em série". Os amplificadores patch-clamp modernos têm circuitos para compensar esse erro, mas compensam apenas 70-80% dele. O eletrofisiologista pode reduzir ainda mais o erro registrando no potencial natural de repouso da célula ou próximo a ele e usando o eletrodo de menor resistência possível.
4. Erros de capacitância. Microeletrodos são capacitores e são particularmente problemáticos porque não são lineares. A capacitância surge porque o eletrólito dentro do eletrodo é separado por um isolador (vidro) da solução externa. Este é, por definição e função, um capacitor. Pior, como a espessura do vidro muda quanto mais você se afasta da ponta, a constante de tempo do capacitor irá variar. Isso produz um registro distorcido da tensão ou corrente da membrana sempre que eles estão mudando. Os amplificadores podem compensar isso, mas não inteiramente porque a capacitância tem muitas constantes de tempo. O experimentador pode reduzir o problema mantendo a solução de banho da célula rasa (expondo menos superfície de vidro ao líquido) e revestindo o eletrodo com silicone, resina, tinta ou outra substância que aumentará a distância entre as soluções internas e externas.
5. Erros de pinça de espaço. Um único eletrodo é uma fonte pontual de corrente. Em partes distantes da célula, a corrente que passa pelo eletrodo terá menos influência do que nas partes próximas da célula. Isso é particularmente um problema ao registrar neurônios com estruturas dendríticas elaboradas. Não há nada que se possa fazer a respeito dos erros de fixação espacial, exceto moderar as conclusões do experimento.

Pinça de tensão de eletrodo único descontínuo (SEVC-d)

Um grampo de tensão de eletrodo único - descontínuo, ou SEVC-d, tem algumas vantagens em relação ao SEVC-c para registro de célula inteira. Nesse caso, uma abordagem diferente é feita para passar a corrente e registrar a tensão. Um amplificador SEVC-d opera em uma base de " compartilhamento de tempo ", de modo que o eletrodo alterna regular e freqüentemente entre a passagem da corrente e a medição da tensão. Na verdade, existem dois eletrodos, mas cada um funciona apenas metade do tempo em que está ligado. A oscilação entre as duas funções do eletrodo único é denominada ciclo de trabalho. Durante cada ciclo, o amplificador mede o potencial de membrana e o compara com o potencial de retenção. Um amplificador operacional mede a diferença e gera um sinal de erro. Esta corrente é uma imagem espelhada da corrente gerada pela célula. As saídas do amplificador apresentam circuitos de amostra e retenção , de modo que cada tensão brevemente amostrada é então mantida na saída até a próxima medição no próximo ciclo. Para ser mais específico, o amplificador mede a tensão nos primeiros microssegundos do ciclo, gera o sinal de erro e gasta o resto do ciclo passando a corrente para reduzir esse erro. No início do próximo ciclo, a voltagem é medida novamente, um novo sinal de erro gerado, corrente passada etc. O experimentador define a duração do ciclo, e é possível amostrar com períodos tão baixos quanto cerca de 15 microssegundos, correspondendo a 67 kHz Freqüência de comutação. Frequências de comutação inferiores a cerca de 10 kHz não são suficientes ao trabalhar com potenciais de ação com menos de 1 milissegundo de largura. Observe que nem todos os amplificadores com grampo de tensão descontínuos suportam frequências de comutação superiores a 10 kHz.

Para que isso funcione, a capacitância da célula deve ser maior do que a capacitância do eletrodo em pelo menos uma ordem de magnitude . A capacitância retarda a cinética (os tempos de subida e descida) das correntes. Se a capacitância do eletrodo for muito menor do que a da célula, quando a corrente passar pelo eletrodo, a voltagem do eletrodo mudará mais rápido do que a voltagem da célula. Assim, quando a corrente é injetada e depois desligada (no final de um ciclo de trabalho), a voltagem do eletrodo decai mais rápido do que a voltagem da célula. Assim que a voltagem do eletrodo assíntota para a voltagem da célula, a voltagem pode ser amostrada (novamente) e a próxima quantidade de carga aplicada. Assim, a frequência do ciclo de trabalho é limitada à velocidade na qual a tensão do eletrodo aumenta e diminui ao passar a corrente. Quanto menor a capacitância do eletrodo, mais rápido o ciclo pode ser feito.

O SEVC-d tem uma grande vantagem sobre o SEVC-c ao permitir que o experimentador meça o potencial da membrana e, como evita a passagem da corrente e a medição da tensão ao mesmo tempo, nunca há um erro de resistência em série. As principais desvantagens são que a resolução de tempo é limitada e o amplificador é instável. Se ela passar muita corrente, de forma que a voltagem do objetivo seja ultrapassada, ela inverte a polaridade da corrente no próximo ciclo de trabalho. Isso faz com que ele ultrapasse a tensão alvo, de forma que o próximo ciclo inverta a polaridade da corrente injetada novamente. Este erro pode aumentar a cada ciclo até que o amplificador oscile fora de controle (“tocando”); isso geralmente resulta na destruição da célula que está sendo gravada. O investigador deseja um ciclo de trabalho curto para melhorar a resolução temporal; o amplificador tem compensadores ajustáveis ​​que farão o decaimento da tensão do eletrodo mais rápido, mas, se estes forem ajustados muito altos, o amplificador tocará, então o investigador está sempre tentando "sintonizar" o amplificador o mais próximo possível da borda da oscilação descontrolada, nesse caso, pequenas alterações nas condições de gravação podem causar toque. Existem duas soluções: “retroceder” as configurações do amplificador em uma faixa segura ou estar alerta para sinais de que o amplificador está prestes a tocar.

Modelagem matemática

x Do ponto de vista da teoria de controle , o experimento de grampo de tensão pode ser descrito em termos da aplicação de uma lei de controle de feedback de saída de alto ganho à membrana neuronal. Matematicamente, a tensão da membrana pode ser modelada por um modelo baseado na condutância com uma entrada dada pela corrente aplicada e uma saída dada pela tensão da membrana . O modelo original baseado em condutância de Hodgkin e Huxley, que representa uma membrana neuronal contendo correntes de íons de sódio e potássio , bem como uma corrente de fuga , é dado pelo sistema de equações diferenciais ordinárias${\ displaystyle I_ {app} (t)}$${\ displaystyle V (t)}$

${\ displaystyle C_ {m} {\ frac {dV} {dt}} = - {\ bar {g}} _ {\ text {K}} n ^ {4} (V-V _ {\ text {K}} ) - {\ bar {g}} _ {\ text {Na}} m ^ {3} h (V-V _ {\ text {Na}}) - {\ bar {g}} _ {\ text {L} } (V-V_ {L}) + I_ {app}}$

${\ displaystyle {\ frac {dp} {dt}} = \ alpha _ {p} (V) (1-p) - \ beta _ {p} (V) p, \ quad p = m, n, h}$

onde representa a capacitância de membrana, , e são máximas, condutâncias , e são potencial de inversão, e são constantes de velocidade dependente da voltagem dos canais de iões, e as variáveis de estado , e são canal iónico gating variáveis . ${\ displaystyle C_ {m}}$${\ displaystyle {\ bar {g}} _ {\ text {Na}}}$${\ displaystyle {\ bar {g}} _ {\ text {K}}}$${\ displaystyle {\ bar {g}} _ {\ text {L}}}$${\ displaystyle V _ {\ text {Na}}}$${\ displaystyle V _ {\ text {K}}}$${\ displaystyle V _ {\ text {L}}}$${\ displaystyle \ alpha _ {p}}$${\ displaystyle \ beta _ {p}}$${\ displaystyle m}$${\ displaystyle h}$${\ displaystyle n}$

É possível mostrar com rigor que a lei de feedback

${\ displaystyle I_ {app} (t) = k (V _ {\ text {ref}} - V (t))}$

conduz a voltagem da membrana arbitrariamente perto da voltagem de referência conforme o ganho é aumentado para um valor arbitrariamente grande. Este fato, que de forma alguma é uma propriedade geral dos sistemas dinâmicos (um alto ganho pode, em geral, levar à instabilidade ), é uma consequência da estrutura e das propriedades do modelo baseado em condutância acima. Em particular, a dinâmica de cada variável de gating , que é impulsionada por , verifica a propriedade de estabilidade forte da contração exponencial. ${\ displaystyle V (t)}$${\ displaystyle V _ {\ text {ref}}}$${\ displaystyle k> 0}$${\ displaystyle p = m, h, n}$${\ displaystyle V}$

Referências

Leitura adicional

• Sherman-Gold R, ed. (1993). "Bioeletricidade" (PDF) . The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques . Axon Instruments. pp. 1–16. OCLC  248830666 .