Vírus adeno-associado auto-complementar - Self-complementary adeno-associated virus
O vírus adeno-associado auto-complementar (scAAV) é um vetor viral desenvolvido a partir do vírus adeno-associado de ocorrência natural (AAV) para ser usado como uma ferramenta para terapia genética . O uso de AAV recombinante (rAAV) tem sido bem-sucedido em ensaios clínicos que abordam uma variedade de doenças. Esta progênie de rAAV feita em laboratório é denominada "auto-complementar" porque a região codificadora foi projetada para formar um molde de DNA intramolecular de fita dupla. Uma etapa de limitação de taxa para o genoma de AAV padrão envolve a síntese de segunda fita, uma vez que o genoma de AAV típico é um molde de DNA de fita simples . No entanto, este não é o caso dos genomas de scAAV. Após a infecção, em vez de esperar pela síntese mediada por células da segunda fita, as duas metades complementares do scAAV se associarão para formar uma unidade de DNA de fita dupla (dsDNA) que está pronta para replicação e transcrição imediatas . A ressalva dessa construção é que, em vez da capacidade de codificação total encontrada no rAAV (4,7-6 kb ), o scAAV pode conter apenas cerca de metade dessa quantidade (≈2,4 kb).
Na aplicação de terapia gênica utilizando rAAV, o vírus transduz a célula com um DNA de fita simples (ssDNA) flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs). Esses ITRs formam grampos de cabelo no final da sequência para servir como iniciadores para iniciar a síntese da segunda fita antes que as etapas subsequentes de infecção possam começar. A síntese da segunda fita é considerada um dos vários blocos para uma infecção eficiente. Vantagens adicionais de scAAV incluem expressão de transgene aumentada e prolongada in vitro e in vivo , bem como "maior estabilidade de DNA in vivo e circularização mais eficaz."
scAAV em terapia genética
scAAV é um vetor atraente para uso em terapia gênica por muitas razões. Seu vetor original, AAV, já está sendo usado em ensaios clínicos. Devido a uma variedade de sorotipos scAAV disponíveis, os cientistas podem escolher um sorotipo que tenha propriedades desejáveis para sua terapia. Selecionar apenas um subconjunto de células melhora a especificidade e reduz o risco de inibição pelo sistema imunológico . Diferentes sorotipos de scAAV e AAV podem transfectar eficientemente uma variedade de alvos celulares. Como todas as abordagens baseadas em vetores para terapia genética, um obstáculo na tradução de terapias de ensaios pré-clínicos em uma aplicação clínica humana será a produção de grandes quantidades de vírus altamente concentrados. produtos entregues via scAAV induzem uma resposta imune mais forte do que os mesmos transgenes entregues por meio de um vetor AAV de fita simples.
Classificação de vírus
Como o AAV, o scAAV é um membro da família Parvoviridae , comumente conhecido como parvovírus . Estes vírus são nonenveloped de ADN de cadeia simples, vírus (ssDNA). Dentro de Parvoviridae, scAAV também pertence ao gênero Dependovirus , caracterizado por uma incapacidade de se replicar por conta própria. Na natureza, esses vírus dependem de outro vírus para fornecer maquinário de replicação; O vírus adeno-associado só pode se replicar durante uma infecção ativa de adenovírus ou alguns tipos de herpesvírus . No uso de laboratório, esse obstáculo é superado pela adição de plasmídeos auxiliares , que expressam exogenamente genes de replicação que o próprio AAV não possui.
Replicação viral
Como um dependovírus, o scAAV permanece em um estado latente dentro da célula até que a célula experimente certas condições permissivas. Isso pode incluir a presença de uma infecção por vírus auxiliar (como adenovírus) ou outros eventos tóxicos, como exposição à luz ultravioleta ou carcinógenos . Como a ORF rep endógena foi substituída pelo transgene, os genes rep fornecidos exogenamente codificam as proteínas necessárias para a replicação do genoma e outros componentes do ciclo de vida viral. Os ITRs localizados 5 'e 3' do genoma viral servem como origem de replicação.
Embalagem viral
Como o rep ORF, o cap ORF do scAAV foi substituído pelo transgene e, portanto, é fornecido exogenamente em um ambiente de laboratório. Os genes codificados nesta ORF constroem proteínas do capsídeo e são responsáveis (junto com o processamento intracelular) por transmitir a especificidade do alvo. As proteínas rep participam da integração do genoma em capsídeos pré-formados. Apesar do fato de que o scAAV é projetado para formar dsDNA após a infecção, as duas fitas complementares não são embaladas em fita dupla. Os parvovírus empacotam seu genoma viral de forma que as bases do ssDNA entrem em contato com os aminoácidos no interior do capsídeo viral. Assim, a sequência de scAAV é provavelmente desenrolada por uma DNA helicase codificada por vírus antes de ser empacotada no capsídeo da proteína viral.