Eletroforese em gel de proteínas - Gel electrophoresis of proteins

Proteínas separadas por SDS-PAGE , coloração com Coomassie Brilliant Blue

A eletroforese de proteínas é um método para analisar as proteínas em um fluido ou extrato. A eletroforese pode ser realizada com um pequeno volume de amostra em uma série de maneiras alternativas com ou sem um meio de suporte: eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (em suma: eletroforese em gel, PAGE ou eletroforese SDS), eletroforese de fluxo livre , eletrofocagem , isotacoforese , electroforese afinidade , imunoelectroforese , counterelectrophoresis , e electroforese capilar . Cada método tem muitas variações com vantagens e limitações individuais. Gel de electroforese é frequentemente realizada em combinação com electrotransfercia imunotransferência para se obter informação adicional sobre uma proteína específica. Devido a limitações práticas, a eletroforese de proteínas geralmente não é adequada como um método preparativo.

Métodos de gel desnaturante

SDS-PAGE

SDS-PAGE, eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio , descreve uma coleção de técnicas relacionadas para separar proteínas de acordo com sua mobilidade eletroforética (uma função do peso molecular de uma cadeia polipeptídica) enquanto no estado desnaturado (desdobrado). Na maioria das proteínas, a ligação de SDS à cadeia polipeptídica confere uma distribuição uniforme de carga por unidade de massa, resultando assim em um fracionamento por tamanho aproximado durante a eletroforese.

SDS é um forte agente detergente usado para desnaturar proteínas nativas em polipeptídeos individuais desdobrados . Quando uma mistura de proteínas é aquecida a 100 ° C na presença de SDS, o detergente envolve a estrutura polipeptídica. Neste processo, as cargas intrínsecas dos polipeptídeos tornam-se insignificantes quando comparadas com as cargas negativas contribuídas pelo SDS. Assim, os polipeptídeos após o tratamento tornam-se estruturas semelhantes a bastonetes possuindo uma densidade de carga uniforme, que é a mesma carga negativa líquida por unidade de comprimento. As mobilidades eletroforéticas dessas proteínas serão uma função linear dos logaritmos de seus pesos moleculares.

Métodos de gel nativo

Os géis nativos, também conhecidos como géis não desnaturantes, analisam proteínas que ainda estão em seu estado dobrado. Assim, a mobilidade eletroforética depende não apenas da relação carga / massa, mas também da forma física e do tamanho da proteína.

PÁGINA nativa azul

BN-PAGE é uma técnica de PAGE nativa , onde o corante Coomassie Brilliant Blue fornece as cargas necessárias aos complexos de proteínas para a separação eletroforética. A desvantagem do Coomassie é que, ao se ligar às proteínas, ele pode agir como um detergente, causando a dissociação dos complexos . Outra desvantagem é a extinção potencial da quimioluminescência (por exemplo, na detecção de Western blot subsequente ou em ensaios de atividade) ou fluorescência de proteínas com grupos protéticos (por exemplo, heme ou clorofila ) ou marcados com corantes fluorescentes.

Limpar PÁGINA nativa

CN-PAGE (comumente referido como Native PAGE) separa proteínas ácidas solúveis em água e de membrana em um gel gradiente de poliacrilamida . Ele não usa corante carregado, então a mobilidade eletroforética das proteínas em CN-PAGE (em contraste com a técnica de mudança de carga BN-PAGE) está relacionada à carga intrínseca das proteínas. A distância de migração depende da carga da proteína, seu tamanho e o tamanho dos poros do gel. Em muitos casos, este método tem resolução inferior do que BN-PAGE, mas CN-PAGE oferece vantagens sempre que o corante Coomassie interfere com outras técnicas analíticas, por exemplo, foi descrito como uma técnica de separação em microescala muito eficiente para análises FRET . Além disso, CN-PAGE é mais suave do que BN-PAGE, de modo que pode reter conjuntos supramoleculares lábeis de complexos de proteínas de membrana que são dissociados nas condições de BN-PAGE.

PÁGINA nativa quantitativa

Os complexos de proteína dobrados de interesse separam-se de forma limpa e previsível devido às propriedades específicas do gel de poliacrilamida. As proteínas separadas são continuamente eluídas em um eluente fisiológico e transportadas para um coletor de frações. Em quatro a cinco frações PAGE cada, os cofatores de metal podem ser identificados e absolutamente quantificados por ICP-MS de alta resolução . As respectivas estruturas das metaloproteínas isoladas podem ser determinadas por espectroscopia de solução NMR .

Sistemas tampão

Migração postulada de proteínas em um sistema de gel Laemmli A: Gel de empilhamento, B: Gel de resolução, o: aplicação da amostra c: descontinuidades no tampão e na matriz eletroforética

A maioria das separações de proteínas são realizadas usando um sistema tampão "descontínuo" (ou DISC) que aumenta significativamente a nitidez das bandas dentro do gel. Durante a eletroforese em um sistema de gel descontínuo, um gradiente de íons é formado no estágio inicial da eletroforese que faz com que todas as proteínas se concentrem em uma única banda nítida. A formação do gradiente de íons é conseguida escolhendo um valor de pH no qual os íons do tampão são apenas moderadamente carregados em comparação com as proteínas revestidas com SDS. Essas condições fornecem um ambiente no qual as reações de Kohlrausch determinam a condutividade molar . Como resultado, as proteínas revestidas com SDS são concentradas várias vezes em uma zona fina da ordem de 19 μm em poucos minutos. Nesta fase, todas as proteínas migram na mesma velocidade de migração por isotacoforese . Isso ocorre em uma região do gel que possui poros maiores para que a matriz do gel não retarde a migração durante o evento de focalização ou "empilhamento". A separação das proteínas por tamanho é alcançada na região inferior de "resolução" do gel. O gel de resolução normalmente tem um tamanho de poro muito menor, o que leva a um efeito de peneiramento que agora determina a mobilidade eletroforética das proteínas. Ao mesmo tempo, a parte separadora do gel também tem um valor de pH no qual os íons do tampão, em média, carregam uma carga maior, fazendo com que "ultrapassem" as proteínas cobertas por SDS e eliminem o gradiente de íons e, portanto, o efeito de empilhamento.

Um sistema tampão descontínuo muito difundido é o sistema tris-glicina ou " Laemmli " que se acumula a um pH de 6,8 e resolve a um pH de ~ 8,3-9,0. Uma desvantagem desse sistema é que esses valores de pH podem promover a formação de ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína nas proteínas porque o pKa da cisteína varia de 8-9 e porque o agente redutor presente no tampão de carregamento não co-migra com as proteínas. Avanços recentes na tecnologia de tamponamento aliviam esse problema resolvendo as proteínas em um pH bem abaixo do pKa da cisteína (por exemplo, bis-tris , pH 6,5) e incluem agentes redutores (por exemplo, bissulfito de sódio) que se movem para o gel antes das proteínas para manter um ambiente redutor. Um benefício adicional de usar tampões com valores de pH mais baixos é que o gel de acrilamida é mais estável em valores de pH mais baixos, de modo que os géis podem ser armazenados por longos períodos de tempo antes do uso.

Eletroforese em gel de gradiente SDS de proteínas

Conforme a voltagem é aplicada, os ânions (e moléculas de amostra carregadas negativamente) migram em direção ao eletrodo positivo (ânodo) na câmara inferior, o íon líder é Cl ^- (alta mobilidade e alta concentração); glicinato é o íon final (baixa mobilidade e baixa concentração). As partículas de proteína SDS não migram livremente na fronteira entre o Cl ^- do tampão de gel e o Gly ^- do tampão de cátodo. Friedrich Kohlrausch descobriu que a lei de Ohm também se aplica a eletrólitos dissolvidos . Devido à queda de tensão entre o Cl ^- e glicina-tampões, proteínas são comprimidos (empilhados) em camadas finas micrómetro. O limite se move através de um gradiente de poro e a pilha de proteínas se dispersa gradualmente devido ao aumento da resistência ao atrito da matriz de gel. O empilhamento e desempilhamento ocorrem continuamente no gel gradiente, para cada proteína em uma posição diferente. Para um desempilhamento completo da proteína, a concentração do gel de poliacrilamida deve exceder 16% T. O sistema de dois gel de "Laemmli" é um gel gradiente simples. A descontinuidade de pH dos tampões não é significativa para a qualidade de separação, e um "gel de empilhamento" com um pH diferente não é necessário.

Visualização

A mancha de proteína mais popular é Coomassie Brilliant Blue . É um corante aniônico, que não se liga especificamente às proteínas. As proteínas do gel são fixadas com ácido acético e coradas simultaneamente. O excesso de corante incorporado ao gel pode ser removido por descoloração com a mesma solução sem o corante. As proteínas são detectadas como faixas azuis em um fundo claro.

Quando um método mais sensível do que a coloração por Coomassie é necessário, geralmente é usada a coloração com prata. A coloração com prata é um procedimento sensível para detectar vestígios de proteínas em géis, mas também pode visualizar ácidos nucléicos ou polissacarídeos.

Métodos de visualização sem o uso de corantes como Coomassie e prata estão disponíveis no mercado. Por exemplo, a Bio-Rad Laboratories comercializa géis "sem manchas" para eletroforese em gel SDS-PAGE. Como alternativa, podem ser usados corantes fluorescentes reversíveis da Azure Biosystems , como AzureRed ou Azure TotalStain Q.

Da mesma forma que na eletroforese em gel de ácido nucléico, o corante de rastreamento é freqüentemente usado. Corantes aniônicos de mobilidade eletroforética conhecida são geralmente incluídos no tampão de amostra. Um corante de rastreamento muito comum é o azul de bromofenol . Este corante é colorido em pH alcalino e neutro e é uma pequena molécula carregada negativamente que se move em direção ao ânodo. Por ser uma molécula altamente móvel, ela se move à frente da maioria das proteínas.

Aplicações médicas

Representação esquemática de um gel de eletroforese de proteínas.

Eletroforese de proteínas séricas mostrando uma paraproteína (pico na zona gama) em um paciente com mieloma múltiplo .

Na medicina , a eletroforese de proteínas é um método de análise de proteínas principalmente no soro sanguíneo . Antes do uso generalizado da eletroforese em gel , a eletroforese de proteínas era realizada como eletroforese de fluxo livre (em papel) ou como imunoeletroforese.

Tradicionalmente, duas classes de proteínas do sangue são consideradas: albumina sérica e globulina . Eles são geralmente iguais em proporção, mas a albumina como uma molécula é muito menor e levemente carregada negativamente, levando a um acúmulo de albumina no gel eletroforético. Uma pequena banda antes da albumina representa a transtirretina (também chamada de pré-albumina ). Algumas formas de medicamentos ou produtos químicos corporais podem causar sua própria banda, mas geralmente é pequena. Bandas anormais (pontas) são vistas na gamopatia monoclonal de significado indeterminado e mieloma múltiplo e são úteis no diagnóstico dessas condições.

As globulinas são classificadas por seu padrão de bandas (com seus principais representantes):

A banda alfa (α) consiste em duas partes, 1 e 2:
- α ₁ - α ₁ -antitripsina , α _1- glicoproteína ácida.
- α ₂ - haptoglobina , α _2- macroglobulina , α ₂ -antiplasmina , ceruloplasmina .
A banda beta (β) - transferrina , LDL , complemento
A banda gama (γ) - imunoglobulina (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). As paraproteínas (no mieloma múltiplo) geralmente aparecem nesta faixa.

O procedimento médico atual normal envolve a determinação de numerosas proteínas no plasma, incluindo hormônios e enzimas, alguns deles também determinados por eletroforese. No entanto, a eletroforese em gel é principalmente uma ferramenta de pesquisa, também quando o assunto são proteínas do sangue.

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