Fusão de beijos e corridas - Kiss-and-run fusion

A fusão Kiss-and-run é um tipo de liberação de vesícula sináptica em que a vesícula abre e fecha transitoriamente. Nessa forma de exocitose , a vesícula acopla e se funde transitoriamente na membrana pré-sináptica e libera seus neurotransmissores através da sinapse , após o que a vesícula pode ser reutilizada.

Kiss-and-run difere da fusão completa, onde a vesícula colapsa totalmente na membrana plasmática e é posteriormente recuperada por um processo dependente de clatrina -revestimento. A ideia de que o neurotransmissor pode ser liberado em "quanta" pela fusão de vesículas sinápticas com a membrana pré-sináptica foi introduzida pela primeira vez por Bernard Katz e Jose del Castillo em 1955, quando as primeiras imagens EM de terminais nervosos apareceram. A possibilidade de fusão transitória e recuperação rápida da membrana vesicular foi proposta por Bruno Ceccarelli em 1973, após exame no microscópio eletrônico de junções neuromusculares de rã fortemente estimuladas e indiretamente apoiadas pelo trabalho de seu grupo nos anos seguintes, utilizando eletrofisiologia, microscopia eletrônica e técnicas de congelamento rápido. O termo real, beijar e correr, foi introduzido pelos colaboradores de Ceccarelli depois que os primeiros estudos de capacitância da membrana simultânea e medições de liberação amperométrica do transmissor foram realizados e indicaram que produtos secretores poderiam realmente ser liberados durante a fusão vesicular transitória. Hoje, há um debate contínuo sobre a fusão completa e a fusão "beijar e correr" e qual modelo retrata uma imagem mais precisa dos mecanismos por trás da liberação sináptica. O aumento do acúmulo de vesículas secretoras parcialmente vazias após a secreção, observado em micrografias eletrônicas, é a evidência mais convincente a favor do modelo beijo e corrida. O acúmulo de vesículas parcialmente vazias após a secreção sugere que durante o processo secretor, apenas uma parte do conteúdo vesicular é capaz de sair da célula, o que só seria possível se as vesículas secretoras estabelecessem temporariamente continuidade com a membrana plasmática da célula, expelissem uma parte de seu conteúdo, em seguida, destaque e lacre novamente.

Descoberta

A fusão de vesículas transitórias foi proposta por Katz e del Castillo em 1955. No entanto, os primeiros estudos sistemáticos foram conduzidos por Ceccarelli et al. em 1973. Ceccarelli et al. estudaram junções neuromusculares de sapos, estimulando-as com marcadores como a peroxidase de rábano para identificar organelas endocitadas e usando protocolos de estimulação leve (2 Hz) ou forte (10 Hz) por períodos que variam de 20 minutos a 4 horas. Em baixa estimulação por um período de 4 horas, Ceccarelli et al. descobriram que houve um aumento nas vesículas marcadas com peroxidase de rábano ao longo do tempo, e nenhum aumento nas organelas grandes, indicativo de que as vesículas se fundem rapidamente com a membrana pré-sináptica e então se separam dela após a liberação de seus neurotransmissores. Eles levantaram a hipótese de que em baixas frequências de estimulação, a maioria das vesículas é rapidamente reformada a partir da membrana pré-sináptica durante e após a estimulação. Outros estudos no laboratório de Ceccarelli acumularam evidências sobre a hipótese de fusão transitória, comparando dados eletrofisiológicos e morfológicos. Em particular, as imagens de fusões de vesículas foram examinadas em membranas pré-sinápticas fraturadas por congelamento e em imagens de microscópio eletrônico obtidas de terminais congelados rapidamente alguns ms após a aplicação de um único choque no nervo. Em 1993, Alvarez de Toledo e colegas demonstraram diretamente a ocorrência de liberação de produto secretor durante a abertura momentânea de uma vesícula de fusão transitória, combinando a medição da capacitância da membrana (que monitora as mudanças na área de superfície) com a detecção amperométrica da liberação de mediadores. Isso levou Fesce et al. para recapitular todas as evidências indiretas em favor da fusão transitória e cunhar o termo beije e corra. A evidência mais convincente para a fusão transitória ou "beijo e corrida" veio da descoberta do porossoma , uma estrutura de lipoproteína em forma de copo permanente na membrana plasmática da célula, onde vesículas secretoras temporariamente encaixam e se fundem para liberar o conteúdo intra-vesicular do célula.

Provas para beijar e correr

Com a descoberta do mecanismo de beijar e correr por Ceccarelli et al., Muitos estudos subsequentes foram feitos que fornecem evidências que apóiam a fusão de beijar e correr. Todos os estudos sugeriram que há duas vantagens principais que a fusão beijo e corrida tem sobre a fusão completa: 1) beijo e corrida permite uma reciclagem de vesículas mais eficiente e 2) beijo e corrida pode limitar a quantidade de neurotransmissor liberado devido a um poro de fusão menor e um tempo mais curto durante o qual os neurotransmissores podem realmente ser liberados. Um dos maiores problemas da evidência beijo e corrida, e subsequentemente a base para muitos contra-argumentos contra o beijo e corrida, é que, como a fusão é tão curta, é muito difícil capturar um evento real de beijo e corrida. No entanto, o acúmulo de vesículas parcialmente vazias após a secreção favorece fortemente o mecanismo de beijo e corrida, sugerindo que durante o processo secretor, apenas uma parte do conteúdo vesicular é capaz de sair da célula, o que só seria possível se as vesículas secretoras fossem estabeleça temporariamente a continuidade com a membrana plasmática da célula, expulse uma parte de seu conteúdo e, a seguir, destaque e feche novamente. Uma vez que os porossomos são estruturas permanentes na membrana plasmática da célula medindo apenas uma fração do tamanho da vesícula secretora, demonstra que as vesículas secretoras "temporariamente" atracam e estabelecem a continuidade, em oposição ao colapso completo.

Células beta pancreáticas de rato

As células beta pancreáticas de rato liberam neurotransmissores por meio da fusão beijo e corrida. Nas células endócrinas e neuroendócrinas , as vesículas semelhantes às sinápticas (SLVs) passam por beijo e corra, mas é controverso se as grandes vesículas de núcleo denso (LDCVs) também passam por beijo e corrida. Estudos demonstraram que os LDCVs sofrem exocitose "beijo e corrida". MacDonald et al. usou várias abordagens para testar a exocitose "kiss-and-run" em células beta de rato. Ao monitorar manchas de membrana de células beta de rato intactas na presença de glicose 10 mM e forscolina 5 mM , MacDonald et al. descobriu que algumas vesículas foram submetidos beijo-and-run, como visto por um evento exocitótica seguido por um endocítica caso de uma magnitude similar. Os eventos Kiss-and-run foram responsáveis ​​por 25% da exocitose do LDCV e 28% da exocitose do SLV. Enquanto o beijo e corrida do LDCV ocorreu 25% do tempo na presença de forscolina, na ausência de forscolina, a fusão do beijo e corrida do LDCV ocorreu apenas 7% das vezes. Como a forscolina aumenta os níveis de AMP cíclico (cAMP), o cAMP aparentemente desempenha um papel muito importante no mecanismo de fusão beijo e corrida do LDCV em células beta pancreáticas de rato.

Os poros de fusão SLV (diâmetro de poro: 0,8 +/- 0,1 nm) e LDCV (diâmetro de poro: 1,4 +/- 0,1 nm) durante beijo e corrida são grandes o suficiente para permitir o efluxo de ácido gama-aminobutírico ( GABA) e trifosfato de adenosina (ATP), mas são muito pequenos para liberar insulina em células beta pancreáticas de rato. Assim, o mecanismo de beijo e corrida pode estar implicado em complicações médicas envolvendo a insulina.

Sinapses hipocampais

Foi demonstrado que a exocitose Kiss-and-run ocorre nas sinapses dos neurônios localizados no hipocampo . Estudos usando FM1-43, um corante anfifílico inserido nas vesículas ou membrana como um marcador, têm sido fundamentais no apoio ao beijo e corrida nas sinapses do hipocampo. Nas sinapses do hipocampo, foi demonstrado que as vesículas permitem a liberação normal de glutamato , um neurotransmissor excitatório no cérebro, sem permitir que o corante FM1-43 entre ou escape da vesícula, indicando um mecanismo transitório sugestivo de beijo e corrida. Aumentos na osmolaridade também mostraram permitir menos liberação de corante nas sinapses do hipocampo. Em várias soluções hipertônicas, 70% mais corante FM1-43 foi liberado de vesículas estimuladas em 0,5 osM do que de vesículas estimuladas em 1,5 osM. As vesículas localizadas em regiões hipertônicas do corpo, portanto, podem ter maior probabilidade de sofrer um modo de beijo e corrida de exocitose.

Mitocôndria

As mitocôndrias demonstram fusão "beijo e corrida" na troca de materiais da membrana interna . Estudos usando a matriz mitocondrial alvejado verde-fotoativado, vermelho-fluorescente KFP e ciano-fotoativado, fluorescência verde PAGFP em células de rato mostraram interações onde o KFP e PAGFP foram transferidos de uma mitocôndria para outra mitocôndria através de fusão transitória, sugerindo um beijo- e-executar o mecanismo. Ao contrário da fusão completa de mitocôndrias, que resultou em uma única organela, a fusão transiente de duas mitocôndrias resultou em duas membranas distintas.

A manipulação do gene da atrofia óptica 1 (Opa1) teve efeitos interessantes na fusão entre as mitocôndrias. O silenciamento do gene Opa1 diminuiu a atividade de fusão total das mitocôndrias após 24 horas, e a atividade de fusão total foi completamente eliminada após o gene Opa1 ter sido silenciado por 48 horas. A atividade de fusão beijo e corrida transitória permaneceu a mesma após 24 horas de silenciamento Opa1. A fusão Kiss-and-run é mais comum com níveis baixos de expressão do gene Opa1 e níveis extremamente altos de expressão do gene Opa1. Como resultado, a expressão Opa1 governa a fusão nas mitocôndrias em relação ao beijo e corrida.

A fusão Kiss-and-run nas mitocôndrias ajuda a manter as mitocôndrias em um estado de motilidade reduzida por um período mais curto em comparação com a fusão completa. Liu et al. testou a fusão beijo e corrida e fusão completa e seus efeitos na motilidade mitocondrial, e descobriu que ambas as formas de fusão resultaram em diminuição da motilidade mitocondrial no início, mas a fusão beijo e corrida restaurou e até aumentou a motilidade mitocondrial imediatamente após o o evento do beijo e corrida acabou. A fusão Kiss-and-run fornece um mecanismo melhor para controlar a bioenergética mitocondrial do que a fusão completa.

Regulamento

Revestimento de actina dependente de cálcio

Acredita-se que a fusão Kiss-and-Run seja estabilizada por um revestimento de actina de vesículas. Testar a captação da vesícula de FM1-43 para observar quando as vesículas se fundiram com a membrana permitiu aos pesquisadores notar que o revestimento de actina é uma etapa necessária para o mecanismo de beijo e corrida. As vesículas marcadas com Beta-actina- proteína fluorescente verde (GFP) fluorescem segundos após a fusão com a membrana pré-sináptica (como mostrado pela captação FM1-43), mas as vesículas não fundidas nunca fluorescem, sugerindo que um revestimento de actina é necessário para o beijo. e corra. Este revestimento de actina veio da polimerização de monômeros de actina.

O processo de revestimento de actina necessário para a fusão "kiss-and-run" transitória é mediado pelo cálcio. O revestimento de actina das vesículas foi inibido por BAPTA-AM, que remove o cálcio. Com a ausência de cálcio pelo uso de BAPTA-AM, todas as vesículas fundidas permaneceram aderidas à membrana pré-sináptica, mas não liberaram seus neurotransmissores, sugerindo que o cálcio é necessário para fazer o revestimento de actina, e que o revestimento de actina é responsável pelo mecanismo para descarga ou liberação da vesícula.

Miosina II

A exocitose Kiss-and-Run é regulada pela miosina II. Estudos usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) em células neuroendócrinas PC12 mostraram que a miosina II regula a dinâmica dos poros de fusão durante a exocitose beijo e corrida. A superexpressão da cadeia leve regulatória da miosina II normal (RLC) em tecido marcado com mRFP (proteína fluorescente vermelha monomérica) e tecido cerebral marcado com Vênus resultou em cinética de liberação prolongada, enquanto a superexpressão de uma forma mutante de RLC de liberação curta de miosina II. cinética. A cinética de liberação prolongada é indicativa de um fechamento mais lento do poro de fusão, de modo que a miosina II também regula a quantidade de neurotransmissor liberada durante a exocitose "kiss-and-run".

SNAREs

Muito debate acadêmico existe sobre o papel das proteínas SNARE na exocitose kiss-and-run. As proteínas SNARE medeiam a fusão das vesículas - a exocitose das vesículas com a membrana pré-sináptica no poro de fusão. Quando uma vesícula se funde com a membrana pré-sináptica, ocorre uma transição SNARE de uma posição trans para uma posição cis , seguida pela dissociação SNARE. Este processo foi considerado irreversível. Se ocorrer exocitose beijo e corrida, entretanto, isso sugeriria que a associação reversível de proteínas SNARE ocorre e medeia o modo beijo e corrida de exocitose. A manipulação das proteínas SNARE durante o beijo e corrida pode fornecer mais informações sobre como as duas se relacionam, e mais pesquisas acadêmicas são necessárias.

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