Peroxidase de rábano - Horseradish peroxidase

Peroxidase de rábano
HRP-xray.png
Peroxidase C1 de rábano.
Identificadores
Organismo Armoracia rusticana
Símbolo Peroxidase C1A
Alt. símbolos PRXC1A
PDB 1W4W Mais estruturas
UniProt P00433
Outros dados
Número CE 1.11.1.7

A enzima peroxidase de rábano ( HRP ), encontrada nas raízes do rábano , é amplamente utilizada em aplicações bioquímicas . É uma metaloenzima com muitas isoformas, das quais o tipo mais estudado é C. Catalisa a oxidação de vários substratos orgânicos pelo peróxido de hidrogênio.

Estrutura

A estrutura da enzima foi resolvida pela primeira vez por cristalografia de raios-X em 1997 e desde então foi resolvida várias vezes com vários substratos. É uma grande glicoproteína alfa-helicoidal que se liga ao heme como um cofator redox .

Substratos

Sozinha, a enzima HRP, ou seus conjugados, tem pouco valor; sua presença deve ser visibilizada por meio de um substrato que, quando oxidado por HRP, utilizando peróxido de hidrogênio como agente oxidante, produza uma alteração de cor característica detectável por métodos espectrofotométricos .

Numerosos substratos para peroxidase de rábano foram descritos e comercializados para explorar as características desejáveis ​​de HRP. Esses substratos se enquadram em várias categorias distintas. HRP catalisa a conversão de substratos cromogênicos (por exemplo, TMB , DAB , ABTS ) em produtos coloridos e produz luz quando atua em substratos quimioluminescentes (por exemplo, Quimioluminescência aprimorada por luminol ).

Alguns dos substratos cromogênicos HRP mais comuns. Luminol é a exceção, pois não é um cromóforo e a luz é gerada após a reação catalisada por HRP.

Formulários

A peroxidase de rábano é uma glicoproteína de 44.173,9 dalton com 6 resíduos de lisina que podem ser conjugados a uma molécula marcada. Ele produz um derivado colorido, fluorimétrico ou luminescente da molécula marcada quando incubado com um substrato adequado, permitindo que seja detectado e quantificado. HRP é freqüentemente usado em conjugados (moléculas que foram unidas geneticamente ou quimicamente) para determinar a presença de um alvo molecular. Por exemplo, um anticorpo conjugado com HRP pode ser usado para detectar uma pequena quantidade de uma proteína específica em um Western blot . Aqui, o anticorpo fornece a especificidade para localizar a proteína de interesse e a enzima HRP, na presença de um substrato, produz um sinal detectável. A peroxidase de rábano também é comumente utilizada em técnicas como ELISA e imunohistoquímica devido à sua natureza monomérica e à facilidade com que produz produtos coloridos. A peroxidase, uma oxidorredutase contendo heme, é uma enzima comercialmente importante que catalisa a clivagem redutiva do peróxido de hidrogênio por um doador de elétrons.

A peroxidase de rábano é ideal em muitos aspectos para essas aplicações porque é menor, mais estável e menos cara do que outras alternativas populares, como a fosfatase alcalina . Ele também tem uma alta taxa de rotatividade que permite a geração de sinais fortes em um intervalo de tempo relativamente curto. Altas concentrações de fosfato diminuem severamente a estabilidade da peroxidase de rábano. Além das aplicações biomédicas, a peroxidase de rábano é uma das enzimas com importantes aplicações ambientais. Esta enzima é adequada para a remoção de compostos aromáticos hidroxilados (HACs) que são considerados poluentes primários em uma ampla variedade de águas residuais industriais.

Além disso, "nos últimos anos, a técnica de marcar neurônios com a enzima peroxidase de rábano tornou-se uma ferramenta importante. Em sua breve história, esse método provavelmente foi usado por mais neurobiologistas do que a coloração de Golgi desde sua descoberta em 1870."

Quimioluminescência aprimorada (ECL)

Artigo principal: Quimioluminescência

A peroxidase de rábano catalisa a oxidação do luminol a 3-aminoftalato por meio de vários intermediários. A reação é acompanhada pela emissão de luz de baixa intensidade a 428 nm. No entanto, na presença de certos produtos químicos, a luz emitida é aumentada em até 1000 vezes, tornando a luz mais fácil de detectar e aumentando a sensibilidade da reação. O aumento da emissão de luz é chamado de quimioluminescência aprimorada (ECL). Vários intensificadores podem ser usados, como os fenóis modificados comumente conhecidos (principalmente iodofenol). No entanto, existem vários substratos no mercado que usam outros intensificadores que resultam em sinais de luminescência até 13 vezes maiores do que os substratos aprimorados com fenol. A intensidade da luz é uma medida do número de moléculas de enzima reagindo e, portanto, da quantidade de híbrido. ECL é simples de configurar e é sensível, detectando cerca de 0,5 pg de ácido nucleico em Southern blots e Northern blots . A detecção por substratos quimioluminescentes tem várias vantagens em relação aos substratos cromogênicos. A sensibilidade é de 10 a 100 vezes maior e a quantificação da emissão de luz é possível em uma ampla faixa dinâmica, enquanto que para precipitados coloridos é muito mais limitada, cerca de uma ordem de magnitude a menos. Filtros de remoção são muito mais fáceis quando substratos quimioluminescentes são usados.

Imita HRP

Muitos materiais foram explorados para imitar o HRP natural. Por exemplo, nanopartículas de óxido de ferro e complexos contendo hemina foram usados ​​para imitar HRP. Essas enzimas artificiais semelhantes a HRP têm sido usadas para muitas aplicações, que vão desde a detecção de biomarcadores e imunocoloração tumoral até antibiofouling.

Veja também

Referências

links externos