Perfil de sequência final - End-sequence profiling

Perfil de sequência final (ESP) (às vezes "mapeamento final emparelhado (PEM)") é um método baseado em conectores marcados em sequência desenvolvidos para facilitar o sequenciamento de genoma de novo para identificar o número de cópias de alta resolução e aberrações estruturais, como inversões e translocações .

Fluxo de trabalho de perfil de sequência final

Resumidamente, o DNA genômico alvo é isolado e parcialmente digerido com enzimas de restrição em grandes fragmentos. Após o fracionamento por tamanho, os fragmentos são clonados em plasmídeos para construir cromossomos artificiais, como cromossomos artificiais bacterianos (BAC), que são então sequenciados e comparados com o genoma de referência. As diferenças, incluindo variações de orientação e comprimento entre os cromossomos construídos e o genoma de referência, irão sugerir o número de cópias e aberração estrutural.

Construção de cromossomos artificiais

Fluxo de trabalho da construção de cromossomos artificiais de bactérias

Antes de analisar a aberração estrutural do genoma alvo e variação do número de cópias (CNV) com ESP, o genoma alvo é geralmente amplificado e conservado com a construção de cromossomos artificiais. A estratégia clássica para construir um cromossomo artificial é o cromossomo artificial bacteriano (BAC). Basicamente, o cromossomo alvo é digerido aleatoriamente e inserido em plasmídeos que são transformados e clonados em bactérias. O tamanho dos fragmentos inseridos é 150–350 kb. Outro cromossomo artificial comumente usado é fosmid. A diferença entre BAC e fosmids é o tamanho do DNA inserido. Os fosmídeos podem conter apenas fragmentos de DNA de 40 kb, o que permite uma determinação mais precisa do ponto de interrupção.

Detecção de aberração estrutural

O perfil de sequência final (ESP) pode ser usado para detectar variações estruturais, como inserções, deleções e rearranjo cromossômico. Em comparação com outros métodos que examinam anormalidades cromossômicas, ESP é particularmente útil para identificar anormalidades neutras de cópia, como inversões e translocações que não seriam aparentes ao observar a variação do número de cópias. A partir da biblioteca BAC, ambas as extremidades dos fragmentos inseridos são sequenciados usando uma plataforma de sequenciamento. A detecção de variações é então alcançada mapeando as leituras sequenciadas em um genoma de referência.

Inversão e translocação

Inversões e translocações são relativamente fáceis de detectar por um par inválido de extremidade sequenciada. Por exemplo, uma translocação pode ser detectada se as extremidades emparelhadas forem mapeadas em cromossomos diferentes no genoma de referência. A inversão pode ser detectada por orientação divergente das leituras, onde a inserção terá duas extremidades positivas ou duas extremidades negativas.

Reorganizações cromossômicas detectadas por ESP

Inserção e exclusão

No caso de uma inserção ou exclusão, o mapeamento da extremidade emparelhada é consistente com o genoma de referência. Mas as leituras são discrepantes em tamanho aparente. O tamanho aparente é a distância das extremidades sequenciadas BAC mapeadas no genoma de referência. Se um BAC tem uma inserção de comprimento (l), um mapeamento concordante mostrará um fragmento de tamanho (l) no genoma de referência. Se as extremidades emparelhadas estiverem mais próximas do que a distância (l), suspeita-se de uma inserção na amostra de DNA. Uma distância de (l <μ-3σ) pode ser usada como corte para detectar uma inserção, onde μ é o comprimento médio da inserção e σ é o desvio padrão. Em caso de exclusão, as extremidades emparelhadas são mapeadas mais longe no genoma de referência em comparação com a distância esperada (l> μ-3σ).

Variação do número da cópia

Copiar alterações de número detectadas pelo ESP

Em alguns casos, as leituras discordantes também podem indicar um CNV, por exemplo, em repetições de sequências. Para CNV maiores, a densidade das leituras irá variar de acordo com o número da cópia. Um aumento no número de cópias será refletido pelo aumento do mapeamento da mesma região no genoma de referência.

História ESP

ESP foi desenvolvido e publicado pela primeira vez em 2003 pelo Dr. Collins e seus colegas na Universidade da Califórnia, em San Francisco. Seu estudo revelou os rearranjos cromossômicos e CNV de células cancerosas humanas MCF7 em uma resolução de 150 kb, que é muito mais preciso em comparação com CGH e cariótipo espectral naquele momento. Em 2007, o Dr. Snyder e seu grupo melhoraram a resolução ESP para 3 kb sequenciando ambos os pares de fragmentos de DNA de 3 kb sem construção BAC. Sua abordagem é capaz de identificar deleções, inversões, inserções com uma resolução média de breakpoint de 644bp, que se aproxima da resolução da reação em cadeia da polimerase (PCR).

Aplicativos ESP

Várias ferramentas de bioinformática podem ser usadas para analisar o perfil de sequência final. Os mais comuns incluem BreakDancer, PEMer, Variation Hunter, common LAW, GASV e Spanner. ESP pode ser usado para mapear a variação estrutural em alta resolução no tecido da doença. Esta técnica é usada principalmente em amostras de tumor de diferentes tipos de câncer. A identificação precisa de anormalidades cromossômicas neutras de cópia é particularmente importante, pois a translocação pode levar a proteínas de fusão, proteínas quiméricas ou proteínas desreguladas que podem ser vistas em tumores. Esta técnica também pode ser usada em estudos de evolução, identificando grandes variações estruturais entre diferentes populações. Métodos semelhantes estão sendo desenvolvidos para várias aplicações. Por exemplo, uma abordagem de sequenciamento de extremidade emparelhada com código de barras Illumina (BIPES) foi usada para avaliar a diversidade microbiana por meio do sequenciamento da etiqueta 16S V6.

Vantagens e limitações

A resolução da detecção de variação estrutural por ESP foi aumentada para um nível semelhante ao PCR e pode ser melhorada pela seleção de fragmentos de DNA de tamanho mais uniforme. ESP pode ser aplicado com ou sem cromossomo artificial construído. Com o BAC, amostras preciosas podem ser imortalizadas e conservadas, o que é particularmente importante para pequenas quantidades de pequenas que são planejadas para análises extensas. Além disso, os BACs que transportam fragmentos de DNA rearranjados podem ser transfectados diretamente in vitro ou in vivo para analisar a função desses arranjos. No entanto, a construção do BAC ainda é cara e trabalhosa. Os pesquisadores devem ter muito cuidado ao escolher a estratégia de que precisam para um projeto específico. Como o ESP olha apenas para sequências curtas de extremidades emparelhadas, ele tem a vantagem de fornecer informações úteis em todo o genoma sem a necessidade de sequenciamento em grande escala. Aproximadamente 100-200 tumores podem ser sequenciados com uma resolução superior a 150 kb em comparação com o sequenciamento de um genoma inteiro.

Referências

Veja também