Mutagênese de saturação de sequência - Sequence saturation mutagenesis
A mutagênese de saturação de sequência ( SeSaM ) é um método de mutagênese aleatória quimioenzimática aplicado para a evolução direcionada de proteínas e enzimas . É uma das técnicas mais comuns de mutagênese por saturação . Em quatro etapas de reação baseadas em PCR , os nucleotídeos fosforotioato são inseridos na sequência do gene , clivados e os fragmentos resultantes alongados por nucleotídeos universais ou degenerados . Esses nucleotídeos são então substituídos por nucleotídeos padrão, permitindo uma ampla distribuição de mutações de ácido nucleico espalhadas pela sequência do gene com preferência por transversões e com um foco único em mutações pontuais consecutivas, ambas difíceis de gerar por outras técnicas de mutagênese. A técnica foi desenvolvida pelo Professor Ulrich Schwaneberg na Jacobs University Bremen e RWTH Aachen University .
Tecnologia, desenvolvimento e vantagens
O SeSaM foi desenvolvido para superar várias das principais limitações encontradas ao trabalhar com métodos de mutagênese padrão baseados em técnicas simples de PCR propenso a erros (epPCR). Essas técnicas de epPCR baseiam-se no uso de polimerases e, portanto, encontram limitações que resultam principalmente da circunstância de que apenas substituições de ácido nucleico únicas, mas muito raramente consecutivas, são realizadas e que essas substituições ocorrem geralmente em posições favorecidas específicas apenas. Além disso, transversões de ácidos nucléicos são muito menos prováveis do que transições e requerem polimerases especificamente projetadas com uma tendência alterada . Essas características das trocas de ácido nucléico catalisadas por epPCR, juntamente com o fato de que o código genético é degenerado, diminuem a diversidade resultante no nível de aminoácidos . Substituições sinônimas levam à preservação de aminoácidos ou mutações conservadoras com propriedades físico-químicas semelhantes, como tamanho e hidrofobicidade, são fortemente prevalentes. Pela introdução não específica de bases universais em cada posição na sequência do gene, SeSaM supera o viés da polimerase favorecendo substituições transitórias em posições específicas, mas abre a sequência completa do gene para uma matriz diversificada de trocas de aminoácidos.
Durante o desenvolvimento do método SeSaM, várias modificações foram introduzidas que permitiram a introdução de várias mutações simultaneamente. Outro avanço do método foi alcançado com a introdução de bases degeneradas ao invés da inosina universal e o uso de DNA polimerases otimizadas, aumentando ainda mais a proporção de transversões introduzidas. Além disso, este método SeSaM-TV + modificado permite e favorece a introdução de duas trocas de nucleotídeos consecutivas, ampliando fortemente o espectro de aminoácidos que podem ser substituídos.
Por várias otimizações, incluindo a aplicação de uma quimera polimerase melhorada na Etapa III do método SeSaM-TV-II e a adição de um nucleotídeo degenerado alternativo para a substituição eficiente de bases de timina e citosina e aumento da frequência de mutação em SeSaM-P / R, gerado as bibliotecas foram melhoradas em relação ao número de transversão e o número de mutações consecutivas foi aumentado para 2–4 mutações consecutivas com uma taxa de mutações consecutivas de até 30%.
Procedimento
O método SeSaM consiste em quatro etapas baseadas em PCR que podem ser executadas em dois a três dias. As partes principais incluem a incorporação de nucleotídeos fosforotioatos, a fragmentação química nessas posições, a introdução de bases universais ou degeneradas e sua substituição por nucleotídeos naturais inserindo mutações pontuais.
Inicialmente, as sequências universais “SeSaM” são inseridas por PCR com primers específicos do gene que se ligam na frente e atrás do gene de interesse. O gene de interesse com suas regiões flanqueadoras é amplificado para introduzir essas sequências SeSaM_fwd e SeSaM_rev e para gerar o modelo para etapas consecutivas de PCR.
Esses modelos gerados, chamados fwd template e rev templates, são agora amplificados em uma reação de PCR com uma mistura pré-definida de fosforotioato e nucleotídeos padrão para garantir uma distribuição uniforme das mutações inseridas em todo o comprimento do gene. Os produtos de PCR da Etapa 1 são clivados especificamente nas ligações de fosforotioato, gerando um pool de fragmentos de DNA de fita simples de diferentes comprimentos a partir do primer universal.
Na Etapa 2 de SeSaM, as fitas simples de DNA são alongadas por uma a várias bases universais ou degeneradas (dependendo da modificação da SeSaM aplicada) catalisadas pela desoxinucleotidil transferase terminal (TdT). Esta etapa é a etapa chave para introduzir as mutações consecutivas características para transformar códons inteiros aleatoriamente.
Subsequentemente, na Etapa 3, é realizada uma PCR que recombina os fragmentos de DNA de fita simples com o modelo reverso de comprimento total correspondente, gerando o gene de fita dupla de comprimento total incluindo bases universais ou degeneradas em sua sequência.
Por substituição das bases universais / degeneradas na sequência do gene por nucleotídeos padrão aleatórios em SeSaM Etapa 4, uma matriz diversificada de sequências de gene de comprimento total com mutações de substituição é gerada, incluindo uma alta carga de transversões e mutações de substituição subsequentes.
Formulários
SeSaM é usado para otimizar proteínas diretamente no nível de aminoácidos, mas também para identificar preliminarmente as posições dos aminoácidos para testar a mutagênese de saturação para a troca ideal de aminoácidos. O SeSaM foi aplicado com sucesso em inúmeras campanhas de evolução direcionada de diferentes classes de enzimas para seu aprimoramento em propriedades selecionadas, como celulase para resistência a líquido iônico, protease com maior tolerância a detergentes, glicose oxidase para aplicação analítica, fitase com maior termoestabilidade e monooxigenase com catalítico melhorado eficiência usando doadores de elétrons alternativos. O SeSaM é patenteado pelo US770374 B2 em mais de 13 países e é uma das tecnologias de plataforma da SeSaM-Biotech GmbH .