Microscopia de contraste de fase - Phase-contrast microscopy
 Um microscópio de contraste de fase
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| Usos | Observação microscópica de material biológico não corado |
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| Inventor | Frits Zernike |
| Fabricante | Leica , Zeiss , Nikon , Olympus e outros |
| Modelo | kgt |
| Itens relacionados | Microscopia de contraste de interferência diferencial , Hoffman microscopia de contraste de modulação- , microscopia quantitativa de contraste de fase |
A microscopia de contraste de fase (PCM) é uma técnica de microscopia óptica que converte mudanças de fase na luz que passa por uma amostra transparente em mudanças de brilho na imagem. Os próprios deslocamentos de fase são invisíveis, mas se tornam visíveis quando mostrados como variações de brilho.
Quando as ondas de luz viajam por um meio diferente do vácuo , a interação com o meio faz com que a amplitude e a fase da onda mudem de uma maneira dependente das propriedades do meio. Mudanças na amplitude (brilho) surgem da dispersão e absorção da luz, que geralmente depende do comprimento de onda e pode dar origem a cores. O equipamento fotográfico e o olho humano são sensíveis apenas às variações de amplitude. Sem arranjos especiais, as mudanças de fase são, portanto, invisíveis. No entanto, as mudanças de fase frequentemente transmitem informações importantes.
A microscopia de contraste de fase é particularmente importante em biologia. Ele revela muitas estruturas celulares que são invisíveis com um microscópio de campo claro , como exemplificado na figura. Essas estruturas se tornaram visíveis aos microscopistas anteriores por meio de coloração , mas isso exigia preparação adicional e morte das células. O microscópio de contraste de fase possibilitou aos biólogos estudar as células vivas e como elas se proliferam por meio da divisão celular . É um dos poucos métodos disponíveis para quantificar a estrutura celular e componentes que não usam fluorescência . Após sua invenção no início dos anos 1930, a microscopia de contraste de fase provou ser um avanço tão grande na microscopia que seu inventor Frits Zernike recebeu o Prêmio Nobel de Física em 1953.
Princípio de trabalho
O princípio básico para tornar as mudanças de fase visíveis na microscopia de contraste de fase é separar a luz iluminante (de fundo) da luz espalhada pelo espécime (que compõe os detalhes do primeiro plano) e manipulá-los de maneira diferente.
A luz iluminante em forma de anel (verde) que passa pelo anel do condensador é focada na amostra pelo condensador. Parte da luz iluminante é espalhada pelo espécime (amarelo). A luz restante não é afetada pela amostra e forma a luz de fundo (vermelha). Ao observar uma amostra biológica não corada, a luz espalhada é fraca e normalmente muda de fase em -90 ° (devido à espessura típica das amostras e à diferença do índice de refração entre o tecido biológico e o meio circundante) em relação à luz de fundo. Isso faz com que o primeiro plano (vetor azul) e o fundo (vetor vermelho) tenham quase a mesma intensidade, resultando em baixo contraste da imagem .
Em um microscópio de contraste de fase, o contraste da imagem é aumentado de duas maneiras: gerando interferência construtiva entre os raios de luz dispersos e de fundo em regiões do campo de visão que contêm o espécime e reduzindo a quantidade de luz de fundo que atinge o plano da imagem . Primeiro, a luz de fundo é deslocada de fase em -90 ° passando-a por um anel de mudança de fase, que elimina a diferença de fase entre o fundo e os raios de luz dispersos.
Quando a luz é então focada no plano da imagem (onde uma câmera ou ocular é colocada), essa mudança de fase faz com que o fundo e os raios de luz dispersos originados de regiões do campo de visão que contêm a amostra (ou seja, o primeiro plano) interfiram construtivamente , resultando em um aumento no brilho dessas áreas em comparação com regiões que não contêm a amostra. Finalmente, o fundo é esmaecido em ~ 70-90% por um anel de filtro cinza ; este método maximiza a quantidade de luz espalhada gerada pela luz de iluminação (ou seja, de fundo), enquanto minimiza a quantidade de luz de iluminação que atinge o plano da imagem. Parte da luz espalhada que ilumina toda a superfície do filtro será deslocada de fase e esmaecida pelos anéis, mas em uma extensão muito menor do que a luz de fundo, que ilumina apenas a mudança de fase e os anéis cinza do filtro.
O acima descreve o contraste de fase negativo . Em sua forma positiva , a luz de fundo é deslocada de fase em + 90 °. A luz de fundo estará assim 180 ° fora de fase em relação à luz espalhada. A luz espalhada será então subtraída da luz de fundo para formar uma imagem com um primeiro plano mais escuro e um fundo mais claro, como mostrado na primeira figura.
Métodos relacionados
O sucesso do microscópio de contraste de fase levou a uma série de métodos de imagem de fase subsequentes . Em 1952, Georges Nomarski patenteou o que hoje é conhecido como microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) . Ele aumenta o contraste criando sombras artificiais, como se o objeto fosse iluminado lateralmente. Mas a microscopia DIC é inadequada quando o objeto ou seu recipiente altera a polarização. Com o uso crescente de recipientes plásticos de polarização em biologia celular, a microscopia DIC é cada vez mais substituída pela microscopia de contraste de modulação de Hoffman , inventada por Robert Hoffman em 1975.
Os métodos tradicionais de contraste de fase aprimoram o contraste opticamente, combinando o brilho e as informações de fase em uma única imagem. Desde a introdução da câmera digital em meados da década de 1990, vários novos métodos de imagem digital de fase foram desenvolvidos, conhecidos coletivamente como microscopia de contraste de fase quantitativa . Esses métodos criam digitalmente duas imagens separadas, uma imagem de campo claro comum e uma imagem chamada de deslocamento de fase . Em cada ponto da imagem, a imagem de deslocamento de fase exibe o deslocamento de fase quantificado induzido pelo objeto, que é proporcional à espessura óptica do objeto.
Veja também
Referências
links externos
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Recursos da biblioteca sobre microscopia de contraste de fase |
- Optical Microscopy Primer - Phase Contrast Microscopy by Florida State University
- Contraste de fase e microscópios de campo escuro (Université Paris Sud)