Purificação de gradiente de solvente em contracorrente multicoluna - Multicolumn countercurrent solvent gradient purification
A purificação por gradiente de solvente em contracorrente em várias colunas (MCSGP) é uma forma de cromatografia usada para separar ou purificar biomoléculas de misturas complexas. Foi desenvolvido no Instituto Federal Suíço de Tecnologia de Zurique por Aumann e Morbidelli. O processo consiste em duas a seis colunas cromatográficas que são conectadas entre si de tal forma que, à medida que a mistura passa pelas colunas, o composto é purificado em várias frações.
Visão geral
O processo MCSGP consiste em várias, pelo menos duas, colunas cromatográficas que são colocadas na posição oposta à direção do fluxo (veja a animação do processo ). A maioria das colunas está equipada com uma bomba de gradiente para ajustar a concentração do modificador na entrada da coluna. Algumas colunas são conectadas diretamente, de modo que os fluxos de produtos não puros são reciclados internamente. Outras colunas estão em curto-circuito, para que operem em modo de lote puro. O sistema é dividido em várias seções, das quais cada seção executa tarefas análogas às tarefas de purificação em lote. Essas tarefas são carregar a alimentação, executar a eluição de gradiente, reciclar as frações do local com baixa adsorção, fracionamento do produto purificado, reciclagem das frações do local com forte adsorção, limpar a coluna de impurezas com forte adsorção, limpar no local e reequilibrar a coluna para iniciar a próxima execução de purificação. Todas as tarefas mencionadas aqui são realizadas ao mesmo tempo em uma unidade. A reciclagem de frações laterais não puras é realizada em movimento contracorrente.
Comparação com outros métodos de purificação
As biomoléculas são frequentemente purificadas por meio de cromatografia em lote de gradiente de solvente . Aqui, gradientes de solvente lineares suaves são aplicados para lidar cuidadosamente com a separação entre o componente desejado e centenas de impurezas. O produto desejado é geralmente intermediário entre impurezas de absorção fraca e forte. Um corte central é necessário para obter o produto puro desejado. Freqüentemente, as resinas preparativas apresentam baixa eficiência devido à forte dispersão axial e à lenta transferência de massa . Então, a purificação em uma etapa cromatográfica não é possível. O movimento de contracorrente , conforme conhecido do processo SMB , seria necessário. Para produções em grande escala e para moléculas muito valiosas, o movimento de contracorrente de sólidos precisa ser aplicado para aumentar a eficiência de separação, o rendimento e a produtividade da purificação. O processo MCSGP combina as duas técnicas em um único processo, o princípio SMB contracorrente e a técnica de lote de gradiente de solvente.
O modo descontínuo consiste em etapas de equilíbrio, carregamento, lavagem, purificação e regeneração. O modo de operação descontínuo permite explorar a vantagem dos gradientes de solvente, mas implica alto consumo de solvente e baixa produtividade em relação aos processos contínuos de contracorrente. Um processo estabelecido desse tipo é a técnica de leito móvel simulado (SMB) que requer as etapas consumidoras de solvente de equilíbrio, lavagem, regeneração apenas uma vez por operação e tem um melhor aproveitamento da resina. No entanto, as principais desvantagens do SMB são a incapacidade de separar uma mistura em três frações e a falta de aplicabilidade do gradiente de solvente. No caso de anticorpos, o estado da técnica é baseado na cromatografia de afinidade em lote (com Proteína A ou Proteína G como ligantes) que é capaz de se ligar seletivamente a moléculas de anticorpo. Em geral, as técnicas de afinidade têm a vantagem de purificar biomoléculas com alto rendimento e pureza, mas as desvantagens são em geral o alto custo da fase estacionária, a lixiviação do ligante e a capacidade de limpeza reduzida.
O processo MCSGP pode resultar em graus de pureza e rendimentos comparáveis aos de purificação utilizando Proteína A . O segundo exemplo de aplicação para o protótipo MCSGP é a separação de três variantes do MAb usando uma resina preparativa de troca catiônica fraca. Embora a variante de MAb de eluição intermediária só possa ser obtida com 80% de pureza em recuperações próximas de zero em um processo cromatográfico em lote, o processo MCSGP pode fornecer 90% de pureza com 93% de rendimento. Uma comparação numérica do processo MCSGP com o processo cromatográfico em lote, e um processo cromatográfico em lote incluindo reciclagem ideal, foi realizada usando uma purificação de polipeptídeo industrial como sistema modelo. Isso mostra que o processo MCSGP pode aumentar a produtividade em um fator de 10 e reduzir a necessidade de solvente em 90%.
As principais vantagens em relação à cromatografia em batelada em gradiente de solvente são altos rendimentos também para separações difíceis, menor consumo de solvente, maior produtividade, uso de movimento de sólidos em contracorrente, o que aumenta a eficiência da separação. O processo é contínuo. Uma vez que um estado estacionário é alcançado, ele fornece produtos continuamente purificados em qualidade e quantidade constantes. A limpeza automática no local é integrada. É possível um projeto empírico puro das condições operacionais de um cromatograma de lote de gradiente de solvente único.
Formulários
Todas as purificações e separações cromatográficas que são executadas por meio de cromatografia em lote de gradiente de solvente podem ser realizadas usando MCSGP. Exemplos típicos são purificação de fase reversa de peptídeos , cromatografia de interação hidrofóbica para ácidos graxos ou, por exemplo, cromatografia de troca iônica de proteínas ou anticorpos . O processo pode enriquecer efetivamente os componentes, que foram alimentados em apenas pequenas quantidades. A captura contínua de anticorpos sem cromatografia de afinidade pode ser realizada com o processo MCSGP.