Água duplamente rotulada - Doubly labeled water
Água duplamente marcada é a água na qual o hidrogênio e o oxigênio foram parcial ou completamente substituídos (ou seja, rotulados ) por um isótopo incomum desses elementos para fins de rastreamento.
Na prática, por razões práticas e de segurança, quase todas as aplicações recentes do método da "água duplamente marcada" usam água marcada com formas pesadas, mas não radioativas de cada elemento ( deutério e oxigênio-18 ). Em teoria, os isótopos pesados radioativos dos elementos poderiam ser usados para tal marcação; este foi o caso em muitas das primeiras aplicações do método.
Em particular, a água duplamente marcada (DLW) pode ser usada como um método para medir a taxa metabólica diária média de um organismo ao longo de um período de tempo (muitas vezes também chamada de taxa metabólica de campo , ou FMR, em animais não humanos). Isso é feito administrando uma dose de DLW e medindo as taxas de eliminação de deutério e oxigênio-18 no sujeito ao longo do tempo (por meio de amostragem regular de concentrações de isótopos pesados na água corporal, por amostragem de saliva, urina ou sangue). São necessárias pelo menos duas amostras: uma amostra inicial (depois que os isótopos alcançaram o equilíbrio no corpo) e uma segunda amostra algum tempo depois. O tempo entre essas amostras depende do tamanho do animal. Em pequenos animais, o período pode ser tão curto quanto 24 horas; em animais maiores (como humanos adultos), o período pode chegar a 14 dias.
O método foi inventado na década de 1950 por Nathan Lifson e colegas da Universidade de Minnesota. No entanto, seu uso era restrito a pequenos animais até a década de 1980 devido ao alto custo do isótopo oxigênio-18. Os avanços na espectrometria de massa durante os anos 1970 e início dos anos 1980 reduziram a quantidade de isótopo necessária, o que tornou viável a aplicação do método a animais maiores, incluindo humanos. A primeira aplicação em humanos foi em 1982, por Dale Schoeller , mais de 25 anos depois que o método foi inicialmente descoberto. Um resumo completo da técnica é fornecido em um livro do biólogo britânico John Speakman .
Mecanismo do teste
A técnica mede a produção de dióxido de carbono de um sujeito durante o intervalo entre a primeira e a última amostra de água corporal. O método depende dos detalhes do metabolismo do carbono em nossos corpos. Quando a respiração celular quebra as moléculas que contêm carbono para liberar energia, o dióxido de carbono é liberado como um subproduto. O dióxido de carbono contém dois átomos de oxigênio e apenas um átomo de carbono, mas as moléculas de alimentos, como os carboidratos, não contêm oxigênio suficiente para fornecer os dois átomos de oxigênio encontrados no CO 2 . Acontece que um dos dois átomos de oxigênio no CO 2 é derivado da água corporal. Se o oxigênio na água for rotulado com 18 O, então o CO 2 produzido pela respiração conterá oxigênio rotulado. Além disso, como o CO 2 viaja do local da respiração através do citoplasma de uma célula, através dos fluidos intersticiais, para a corrente sanguínea e então para os pulmões, parte dele é reversivelmente convertido em bicarbonato. Assim, após consumir água marcada com 18 O, o 18 O se equilibra com o bicarbonato do corpo e o reservatório de dióxido de carbono dissolvido (por meio da ação da enzima anidrase carbônica ). Como dióxido de carbono exalado é, 18 S é perdido a partir do corpo. Isto foi descoberto por Lifson em 1949. No entanto, 18 O, também é perdido através da perda de água do corpo (tal como urina e evaporação de fluidos). No entanto, o deutério (o segundo rótulo na água duplamente rotulada) é perdido apenas quando a água corporal é perdida. Assim, a perda de deutério na água corporal ao longo do tempo pode ser usada para compensar matematicamente a perda de 18 O pela rota de perda de água. Isso deixa apenas a perda líquida restante de 18 O em dióxido de carbono. Esta medição da quantidade de dióxido de carbono perdido é uma estimativa excelente para a produção total de dióxido de carbono. Uma vez que isso seja conhecido, a taxa metabólica total pode ser estimada a partir de suposições simplificadas sobre a proporção de oxigênio usado no metabolismo (e, portanto, o calor gerado), para o dióxido de carbono eliminado (ver quociente respiratório ). Este quociente pode ser medido de outras maneiras, quase sempre tem um valor entre 0,7 e 1,0, e para uma dieta mista é geralmente cerca de 0,8.
Em termos leigos:
- O metabolismo pode ser calculado a partir de entrada de oxigênio / saída de CO 2 .
- Água DLW ('marcada') é hidrogênio rastreável (deutério) e oxigênio rastreável ( 18 O).
- O 18 O deixa o corpo de duas maneiras: (i) CO 2 exalado e (ii) perda de água na (principalmente) urina, suor e respiração.
- Mas o deutério sai apenas da segunda maneira (perda de água).
Pela perda de deutério, sabemos quanto da água marcada deixou o corpo na forma de água. E, uma vez que a concentração de 18 O na água do corpo é medida após a dose indicada no rótulo, também sabemos quanto do oxigênio marcado deixou o corpo na água. (Uma visão mais simples é que a proporção de deutério para 18 O na água corporal é fixa, então a taxa de perda total de deutério do corpo multiplicada por esta proporção dá imediatamente a taxa de perda de 18 O na água.) Medição de 18 O a diluição com o tempo dá a perda total deste isótopo por todas as rotas (por água e respiração). Como a proporção de 18 O para o oxigênio total da água no corpo é medida, podemos converter a perda de 18 O na respiração em oxigênio total perdido do reservatório de água do corpo por meio da conversão em dióxido de carbono. A quantidade de oxigênio que saiu do corpo na forma de CO 2 é igual ao CO 2 produzido pelo metabolismo, uma vez que o corpo só produz CO 2 por essa via. A perda de CO 2 nos diz a energia produzida, se sabemos ou podemos estimar o quociente respiratório (relação entre CO 2 produzido e oxigênio utilizado).
Administração prática de isótopos
A água duplamente marcada pode ser administrada por injeção ou por via oral (a via usual em humanos). Uma vez que os isótopos serão diluídos na água corporal, não há necessidade de administrá-los em um estado de alta pureza isotópica, não há necessidade de empregar água em que todos ou mesmo a maioria dos átomos são átomos pesados, ou mesmo começar com água que é duplamente etiquetada. Também é desnecessário administrar exatamente um átomo de 18 O para cada dois átomos de deutério. Na prática, essa questão é governada pela economia de comprar água enriquecida com 18 O e pela sensibilidade do equipamento de espectrografia de massa disponível.
Na prática, as doses de água duplamente marcada para trabalho metabólico são preparadas simplesmente misturando uma dose de óxido de deutério ( água pesada ) (90 a 99%) com uma segunda dose de H 2 18 O, que é água que foi enriquecida separadamente com 18 O (embora normalmente não em um nível alto, já que fazer isso seria caro e desnecessário para esse uso), mas, de outra forma, contém hidrogênio normal. A amostra de água misturada contém então os dois tipos de átomos pesados, em um grau muito mais alto do que a água normal, e agora está "duplamente marcada". O livre intercâmbio de hidrogênios entre as moléculas de água (via ionização normal) na água líquida garante que as piscinas de oxigênio e hidrogênio em qualquer amostra de água (incluindo a piscina de água do corpo) sejam equilibradas separadamente em um curto período de tempo com qualquer dose de adição isótopos pesados.
Formulários
O método da água duplamente marcada é particularmente útil para medir a taxa metabólica média (taxa metabólica de campo) durante períodos de tempo relativamente longos (alguns dias ou semanas), em assuntos para os quais outros tipos de medições calorimétricas diretas ou indiretas da taxa metabólica seriam difíceis ou impossível. Por exemplo, a técnica pode medir o metabolismo de animais no estado selvagem, com os problemas técnicos relacionados principalmente a como administrar a dose de isótopo e coletar várias amostras de água corporal em momentos posteriores para verificar a eliminação diferencial de isótopos.
A maioria dos estudos em animais envolve capturar os animais em questão e injetá-los, e então mantê-los por um período variável antes que a primeira amostra de sangue seja coletada. Este período depende do tamanho do animal envolvido e varia entre 30 minutos para animais muito pequenos e 6 horas para animais muito maiores. Em animais e humanos, o teste é mais preciso se uma única determinação do quociente respiratório foi feita para o organismo que ingere a dieta padrão no momento da medição, uma vez que este valor muda relativamente pouco (e mais lentamente) em comparação com o muito maiores alterações da taxa metabólica relacionadas à termorregulação e à atividade.
Como os isótopos pesados de hidrogênio e oxigênio usados na medição padrão da água duplamente marcada são não radioativos e também não tóxicos nas doses usadas (veja água pesada ), a medição da água duplamente marcada da taxa metabólica média tem sido usada extensivamente em humanos voluntários, e até mesmo em bebês e mulheres grávidas. A técnica foi usada em mais de 200 espécies de animais selvagens (principalmente aves, mamíferos e alguns répteis). As aplicações do método em animais foram revisadas. Um artigo de Pontzer, Yamada, Sagayama e colegas em 2021 resumiu os resultados de mais de 6400 medições usando a técnica em humanos com idades entre 8 dias e 96 anos.
Água duplamente marcada ( 2 H 2 18 O) também pode ser usada para gelo incomumente quente e água incomumente densa, pois tem um ponto de fusão mais alto e é mais densa do que a água leve ou o que normalmente se entende por "água pesada" ( 2 H 2 16 O). 2 H 2 18 O derrete a 4,00 ~ 4,04 ° C (39,2 ° F ~ 39,27 ° F) e o líquido atinge sua densidade máxima de 1,21684 ~ 1,21699 g / cm 3 a 11,43 ~ 11,49 ° C (52,57 ° F ~ 52,68 ° F )