Cromatografia de camada fina - Thin-layer chromatography

Cromatografia de camada fina

Separação de tinta preta em uma placa TLC
Acrônimo	TLC
Classificação	Cromatografia
Outras técnicas
Relacionado

TLC de três padrões (orto-, meta- e para-isômeros) e uma amostra

Placa fluorescente de TLC sob luz ultravioleta (UV)

A cromatografia em camada fina (TLC) é uma técnica cromatográfica usada para separar misturas não voláteis. A cromatografia em camada fina é realizada em uma folha de um substrato inerte, como vidro, plástico ou folha de alumínio, que é revestida com uma camada fina de material adsorvente , geralmente sílica gel , óxido de alumínio (alumina) ou celulose . Essa camada de adsorvente é conhecida como fase estacionária .

Após a aplicação da amostra na placa, um solvente ou mistura de solventes (conhecida como fase móvel ) é aspirada da placa por ação capilar . Como diferentes analitos sobem na placa de TLC em taxas diferentes, a separação é alcançada. A fase móvel possui propriedades diferentes da fase estacionária. Por exemplo, com a sílica gel, uma substância muito polar , são utilizadas fases móveis não polares, como o heptano . A fase móvel pode ser uma mistura, permitindo que os químicos ajustem as propriedades de volume da fase móvel.

Após o experimento, os pontos são visualizados. Freqüentemente, isso pode ser feito simplesmente projetando luz ultravioleta na folha; as folhas são frequentemente tratadas com fósforo e manchas escuras aparecem na folha, onde os compostos absorvem a luz que incide sobre uma determinada área. Processos químicos também podem ser usados ​​para visualizar manchas; o anisaldeído , por exemplo, forma adutos coloridos com muitos compostos, e o ácido sulfúrico carbonizará a maioria dos compostos orgânicos, deixando uma mancha escura na folha.

Para quantificar os resultados, a distância percorrida pela substância em questão é dividida pela distância total percorrida pela fase móvel, essa relação é chamada de fator de retardo ( R _f ), ou às vezes coloquialmente como fator de retenção . Para que o resultado seja quantitativo, a absorção de solvente deve ser interrompida antes que a fase móvel chegue ao final da fase estacionária. Em geral, uma substância cuja estrutura se assemelha à fase estacionária terá baixo R _f , enquanto outra que possui uma estrutura semelhante à fase móvel terá alto fator de retardo. Fatores de retardo são característicos, mas mudarão dependendo da condição exata da fase móvel e estacionária. Por esse motivo, os químicos geralmente aplicam uma amostra de um composto conhecido à folha junto com as amostras desconhecidas.

A cromatografia em camada fina pode ser usada para monitorar o progresso de uma reação, identificar compostos presentes em uma determinada mistura e determinar a pureza de uma substância. Exemplos específicos dessas aplicações incluem: análise de ceramidas e ácidos graxos , detecção de pesticidas ou inseticidas em alimentos e água, análise da composição de corantes de fibras em perícia , ensaio da pureza radioquímica de radiofármacos ou identificação de plantas medicinais e seus constituintes

Uma série de melhorias podem ser feitas no método original para automatizar as diferentes etapas, para aumentar a resolução alcançada com TLC e para permitir uma análise quantitativa mais precisa. Este método é conhecido como HPTLC ou "TLC de alto desempenho". HPTLC normalmente usa camadas mais finas de fase estacionária e volumes de amostra menores, reduzindo assim a perda de resolução devido à difusão .

Preparação da placa

Placas de TLC estão geralmente disponíveis comercialmente, com intervalos de tamanho de partícula padrão para melhorar a reprodutibilidade . Eles são preparados pela mistura do adsorvente, como a sílica gel , com uma pequena quantidade de ligante inerte como o sulfato de cálcio (gesso) e água. Esta mistura é espalhada como uma pasta espessa em uma folha de suporte não reativa, geralmente vidro , folha de alumínio espessa ou plástico. A placa resultante é seca e ativada por aquecimento em um forno por trinta minutos a 110 ° C. A espessura da camada absorvente é normalmente de cerca de 0,1–0,25 mm para fins analíticos e cerca de 0,5–2,0 mm para TLC preparativa.

Técnica

O processo é semelhante à cromatografia em papel, com a vantagem de execuções mais rápidas, melhores separações e a escolha entre diferentes fases estacionárias. Por causa de sua simplicidade e velocidade, o TLC é frequentemente usado para monitorar reações químicas e para a análise qualitativa de produtos de reação. As placas podem ser etiquetadas antes ou depois do processo de cromatografia usando um lápis ou outro instrumento que não interfira ou reaja com o processo.

Para executar uma placa de cromatografia em camada fina, o seguinte procedimento é realizado:

• Usando um tubo capilar, um pequeno ponto de solução contendo a amostra é aplicado em uma placa, cerca de 1,5 centímetros da borda inferior. O solvente pode evaporar completamente para evitar que ele interfira nas interações da amostra com a fase móvel na próxima etapa. Se um solvente não volátil foi usado para aplicar a amostra, a placa precisa ser seca em uma câmara de vácuo . Esta etapa é frequentemente repetida para garantir que haja analito suficiente no ponto inicial da placa para obter um resultado visível. Amostras diferentes podem ser colocadas em uma fileira de pontos à mesma distância da borda inferior, cada um dos quais se moverá em sua própria pista adjacente a partir de seu próprio ponto de partida.
• Uma pequena quantidade de um solvente apropriado (eluente) é vertida em um copo de vidro ou qualquer outro recipiente transparente adequado (câmara de separação) a uma profundidade de menos de 1 centímetro. Uma tira de papel de filtro (também conhecido como "pavio") é colocada na câmara de modo que seu fundo toque o solvente e o papel fique na parede da câmara e alcance quase o topo do recipiente. O recipiente é fechado com uma lamela de vidro ou qualquer outra tampa e é deixado por alguns minutos para que os vapores do solvente subam pelo papel de filtro e sature o ar da câmara. (A falha em saturar a câmara resultará em má separação e resultados não reproduzíveis.)
• A placa de TLC é então colocada na câmara de modo que os pontos da amostra não toquem a superfície do eluente na câmara, e a tampa é fechada. O solvente sobe na placa por ação capilar , encontra a mistura da amostra e a carrega para cima na placa (elui a amostra). A placa deve ser removida da câmara antes que a frente do solvente atinja o topo da fase estacionária (a continuação da eluição dará um resultado enganoso) e seca.
• Sem demora, a frente do solvente , a extensão máxima do solvente na placa, é marcada.
• A placa é visualizada. Como algumas placas são pré-revestidas com um fósforo, como sulfeto de zinco , permitindo que muitos compostos sejam visualizados usando luz ultravioleta ; manchas escuras aparecem onde os compostos bloqueiam a luz ultravioleta de atingir a placa. Alternativamente, as placas podem ser pulverizadas ou imersas em produtos químicos após a eluição. Vários agentes de visualização reagem com as manchas para produzir resultados visíveis.

Processo de separação e princípio

Diferentes compostos na mistura da amostra viajam em taxas diferentes devido às diferenças em sua atração pela fase estacionária e por causa das diferenças na solubilidade no solvente. Alterando o solvente, ou talvez usando uma mistura, a separação de componentes (medida pelo valor R _f ) pode ser ajustada. Além disso, a separação alcançada com uma placa de TLC pode ser usada para estimar a separação de uma coluna de cromatografia flash . (Um composto elui de uma coluna quando a quantidade de solvente coletado é igual a 1 / R _f .) Químicos freqüentemente usam TLC para desenvolver um protocolo de separação por cromatografia e usam TLC para determinar quais frações contêm os compostos desejados.

Desenvolvimento de uma placa TLC. Uma mancha roxa se separa em uma mancha vermelha e azul.

A separação de compostos é baseada na competição do soluto e da fase móvel por sítios de ligação na fase estacionária. Por exemplo, se a sílica gel de fase normal for usada como fase estacionária, ela pode ser considerada polar. Dados dois compostos que diferem em polaridade, o composto mais polar tem uma interação mais forte com a sílica e é, portanto, mais capaz de deslocar a fase móvel dos locais de ligação disponíveis. Como consequência, o composto menos polar se move para cima na placa (resultando em um valor de R _{f mais} alto). Se a fase móvel for alterada para um solvente ou mistura de solventes mais polar, ela se tornará melhor na ligação à placa polar e, portanto, deslocará os solutos dela, de modo que todos os compostos na placa de TLC se moverão para cima na placa. É comumente dito que solventes "fortes" (eluentes) empurram os compostos analisados ​​para cima na placa, enquanto eluentes "fracos" mal os movem. A ordem de força / fraqueza depende do revestimento (fase estacionária) da placa TLC. Para placas de TLC revestidas com gel de sílica, a força do eluente aumenta na seguinte ordem: perfluoroalcano (mais fraco), hexano , pentano , tetracloreto de carbono , benzeno / tolueno , diclorometano , éter dietílico , acetato de etila , acetonitrila , acetona , 2-propanol / n -butanol , água , metanol , trietilamina , ácido acético , ácido fórmico (mais forte). Para placas revestidas com C18 , a ordem é inversa. Em outras palavras, quando a fase estacionária é polar e a fase móvel é apolar, o método é a fase normal em oposição à fase reversa . Isto significa que se uma mistura de acetato de etilo e hexano como a fase móvel é utilizado, a adição de mais acetato de etilo resultados em maior R _f valores para todos os compostos à placa de TLC. Alterar a polaridade da fase móvel normalmente não resultará na ordem inversa de execução dos compostos na placa de TLC. Uma série eluotrópica pode ser usada como um guia na seleção de uma fase móvel. Se uma ordem inversa de execução dos compostos for desejada, uma fase estacionária apolar deve ser usada, como a sílica funcionalizada C18.

Análise

Como os produtos químicos sendo separados podem ser incolores, existem vários métodos para visualizar as manchas:

• Analitos fluorescentes, como quinino , podem ser detectados sob luz negra (366 nm)
• Freqüentemente, uma pequena quantidade de um composto fluorescente , geralmente silicato de zinco ativado por manganês , é adicionada ao adsorvente que permite a visualização de manchas sob luz UV-C (254 nm). A camada adsorvente irá então apresentar fluorescência verde-clara por si mesma, mas manchas de analito apagam essa fluorescência.
• Os vapores de iodo são um reagente de cor inespecífico geral
• Existem reagentes de cor específicos nos quais a placa de TLC é mergulhada ou que são pulverizados sobre a placa.
  • Permanganato de potássio - oxidação
  • Bromo
  • Vanilina ácida
  • Ácido fosfomolíbdico

• No caso de lipídios, o cromatograma pode ser transferido para uma membrana de fluoreto de polivinilideno e então submetido a análises adicionais, por exemplo espectrometria de massa , uma técnica conhecida como far-Eastern blot .

Uma vez visível, o R _f valor, ou factor de retardamento , de cada ponto pode ser determinado dividindo a distância do produto percorrida pela distância a frente do solvente explorada utilizando o site da mancha inicial como referência. Esses valores dependem do solvente usado e do tipo de placa de TLC e não são constantes físicas.

Formulários

Caracterização

Em química orgânica , as reações são monitoradas qualitativamente com TLC. Os pontos amostrados com um tubo capilar são colocados na placa: um ponto do material de partida, um ponto da mistura de reação e um ponto cruzado com ambos. Uma pequena placa de TLC (3 por 7 cm) leva alguns minutos para funcionar. A análise é qualitativa e mostrará se o material de partida desapareceu, ou seja, a reação está completa, se algum produto apareceu e quantos produtos são gerados (embora isso possa estar subestimado devido à coeluição). Infelizmente, TLCs de reações de baixa temperatura podem dar resultados enganosos, porque a amostra é aquecida à temperatura ambiente no capilar, o que pode alterar a reação - a amostra aquecida analisada por TLC não é a mesma que está no frasco de baixa temperatura . Uma dessas reações é a redução do DIBALH do éster a aldeído.

Em um estudo, a TLC foi aplicada na triagem de reações orgânicas , por exemplo, no ajuste fino da síntese de BINAP a partir de 2-naftol . Neste método, o álcool e a solução de catalisador (por exemplo, cloreto de ferro (III) ) são colocados separadamente na linha de base, depois reagem e, em seguida, são analisados ​​instantaneamente.

Uma aplicação especial da TLC é na caracterização de compostos radiomarcados, onde é usada para determinar a pureza radioquímica . A folha TLC é visualizada usando uma folha de filme fotográfico ou um instrumento capaz de medir a radioatividade . Pode ser visualizado por outros meios também. Este método é muito mais sensível que os outros e pode ser usado para detectar uma quantidade extremamente pequena de um composto, desde que ele carregue um átomo radioativo.

Isolamento

Uma vez que diferentes compostos percorrerão uma distância diferente na fase estacionária, a cromatografia pode ser usada para isolar os componentes de uma mistura para análise posterior. Os compostos separados, cada um ocupando uma área específica na placa, podem ser raspados (junto com as partículas da fase estacionária) e dissolvidos em um solvente apropriado. Por exemplo, na cromatografia de um extrato de material vegetal verde (por exemplo, espinafre ) mostrado em 7 estágios de desenvolvimento, o caroteno elui rapidamente e só é visível até a etapa 2. A clorofila A e B estão na metade do passo final e a luteína no primeiro composto com coloração amarela. Uma vez terminada a cromatografia, o caroteno pode ser removido da placa, extraído em um solvente e colocado em um espectrofotômetro para determinar seu espectro. As quantidades extraídas são pequenas e uma técnica como a cromatografia em coluna é preferida para separar quantidades maiores. No entanto, grandes placas preparativas de TLC com revestimentos de sílica gel espessos podem ser usadas para separar mais de 100 mg de material.

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  Passo 1

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  Passo 2

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  etapa 3

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  Passo 4

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  Etapa 5

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  Etapa 6

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  Etapa 7

Examinando reações e estabilidade do composto

TLC também é usado para a identificação da conclusão de qualquer reação química. Para determinar isso, observa-se que no início de uma reação todo o local é ocupado pelos produtos químicos ou materiais iniciais na placa. À medida que a reação começa a ocorrer, o ponto formado pelos produtos químicos iniciais começa a reduzir e, eventualmente, substitui todo o local dos produtos químicos iniciais por um novo produto presente na placa. A formação de um ponto inteiramente novo determina a conclusão de uma reação.

Além disso, a TLC bidimensional é frequentemente usada como um método para verificar se um composto é estável na fase estacionária (como o gel de sílica, que geralmente é ligeiramente ácido). Para isso, a mistura de compostos testados é eluída duas vezes em uma placa de TLC quadrada, primeiro em uma direção e depois girada 90º. Se o composto alvo aparecer na diagonal do quadrado, ele é estável em sílica gel e seguro para purificar. Se aparecer abaixo da diagonal, está se decompondo em gel de sílica. Se for este o caso, a purificação pode ser tentada usando sílica gel neutralizada (com trietilamina , por exemplo), ou uma fase estacionária alternativa, como alumina neutra .

Veja também

• Cromatografia radial

Referências

Bibliografia