Mutagênese dirigida ao local - Site-directed mutagenesis

A mutagênese dirigida ao local é um método de biologia molecular usado para fazer alterações específicas e intencionais na sequência de DNA de um gene e em quaisquer produtos gênicos . Também chamada de mutagênese específica do local ou mutagênese dirigida por oligonucleotídeo , é usada para investigar a estrutura e a atividade biológica de DNA , RNA e moléculas de proteína e para a engenharia de proteínas .

A mutagênese dirigida ao local é uma das técnicas de laboratório mais importantes para a criação de bibliotecas de DNA pela introdução de mutações em sequências de DNA. Existem numerosos métodos para alcançar a mutagênese dirigida ao local, mas com custos decrescentes de síntese de oligonucleotídeos , a síntese artificial de genes é agora ocasionalmente usada como uma alternativa à mutagênese dirigida ao local. Desde 2013, o desenvolvimento da tecnologia CRISPR / Cas9, baseada em um sistema de defesa viral procariótico, também permitiu a edição do genoma , e a mutagênese pode ser realizada in vivo com relativa facilidade.

História

As primeiras tentativas de mutagênese usando radiação ou mutagênicos químicos não eram específicas para o local, gerando mutações aleatórias. Análogos de nucleotídeos e outros produtos químicos foram posteriormente usados ​​para gerar mutações pontuais localizadas , exemplos de tais produtos químicos são aminopurina , nitrosoguanidina e bissulfito . A mutagénese dirigida foi alcançada em 1974 no laboratório de Charles Weissmann utilizando um análogo de nucleótido N 4 hidroxicitidina, que induz a transição de GC para AT. Esses métodos de mutagênese, entretanto, são limitados pelo tipo de mutação que podem atingir e não são tão específicos quanto os métodos posteriores de mutagênese dirigida ao local.

Em 1971, Clyde Hutchison e Marshall Edgell mostraram que é possível produzir mutantes com pequenos fragmentos do fago ϕX174 e nucleases de restrição . Hutchison posteriormente produziu com seu colaborador Michael Smith em 1978 uma abordagem mais flexível para mutagênese dirigida ao local usando oligonucleotídeos em um método de extensão de primer com DNA polimerase. Por sua parte no desenvolvimento desse processo, Michael Smith mais tarde dividiu o Prêmio Nobel de Química em outubro de 1993 com Kary B. Mullis , que inventou a reação em cadeia da polimerase .

Mecanismo básico

O procedimento básico requer a síntese de um curto primer de DNA. Este primer sintético contém a mutação desejada e é complementar ao DNA molde em torno do local da mutação, de modo que pode hibridizar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma única mudança de base (uma mutação pontual ), múltiplas mudanças de base, exclusão ou inserção . O primer de fita simples é então estendido usando uma DNA polimerase , que copia o resto do gene. O gene assim copiado contém o sítio mutado e é então introduzido em uma célula hospedeira em um vetor e clonado . Finalmente, os mutantes são selecionados por sequenciamento de DNA para verificar se eles contêm a mutação desejada.

Abordagens

O método original usando extensão de primer único era ineficiente devido ao baixo rendimento de mutantes. Esta mistura resultante contém o molde original não mutado, bem como a fita mutante, produzindo uma população mista de progênies mutantes e não mutantes. Além disso, o modelo usado é metilado enquanto a fita mutante não é metilada, e os mutantes podem ser contra-selecionados devido à presença de sistema de reparo de incompatibilidade que favorece o DNA modelo metilado, resultando em menos mutantes. Muitas abordagens foram desenvolvidas desde então para melhorar a eficiência da mutagênese.

Um grande número de métodos está disponível para efetuar a mutagênese dirigida ao local, embora a maioria deles raramente tenha sido usada em laboratórios desde o início dos anos 2000, já que as novas técnicas permitem maneiras mais simples e fáceis de introduzir mutações específicas do local nos genes.

Método de Kunkel

Em 1985, Thomas Kunkel introduziu uma técnica que reduz a necessidade de seleção de mutantes. O fragmento de DNA a ser mutado é inserido em um fagemídeo como M13mp18 / 19 e é então transformado em uma cepa de E. coli deficiente em duas enzimas, dUTPase ( dut ) e uracil deglicosidase ( udg ). Ambas as enzimas são parte de uma via de reparo de DNA que protege o cromossomo bacteriano de mutações pela desaminação espontânea de dCTP em dUTP. A deficiência de dUTPase impede a quebra de dUTP, resultando em um alto nível de dUTP na célula. A deficiência de deglicosidase de uracila impede a remoção de uracila do DNA recém-sintetizado. Como a E. coli mutante dupla replica o DNA do fago, sua maquinaria enzimática pode, portanto, incorporar erroneamente dUTP em vez de dTTP, resultando em DNA de fita simples que contém alguns uracilos (ssUDNA). O ssUDNA é extraído do bacteriófago que é liberado no meio e, em seguida, usado como molde para mutagênese. Um oligonucleotídeo contendo a mutação desejada é usado para extensão do iniciador. O DNA heteroduplex, que se forma, consiste em uma fita parental não mutada contendo dUTP e uma fita mutada contendo dTTP. O DNA é então transformado em uma cepa de E. coli carregando os genes dut e udg do tipo selvagem . Aqui, a fita de DNA parental contendo uracila é degradada, de modo que quase todo o DNA resultante consiste na fita com mutação.

Mutagênese de cassete

Ao contrário de outros métodos, a mutagênese de cassete não precisa envolver a extensão do primer usando a DNA polimerase. Neste método, um fragmento de DNA é sintetizado e, em seguida, inserido em um plasmídeo. Envolve a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo e subsequente ligação de um par de oligonucleotídeos complementares contendo a mutação no gene de interesse para o plasmídeo. Normalmente, as enzimas de restrição que cortam o plasmídeo e o oligonucleotídeo são as mesmas, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e da inserção se liguem uma à outra. Este método pode gerar mutantes com eficiência próxima de 100%, mas é limitado pela disponibilidade de locais de restrição adequados flanqueando o local que será mutado.

Mutagênese direcionada ao local de PCR

Descrição de uma maneira comum de clonar uma biblioteca de mutagênese dirigida ao local (ou seja, usando oligos degenerados). O gene de interesse é PCRed com oligos que contêm uma região que é perfeitamente complementar ao modelo (azul) e que difere do modelo por um ou mais nucleotídeos (vermelho). Muitos desses primers contendo degenerescência na região não complementar são agrupados na mesma PCR, resultando em muitos produtos de PCR diferentes com mutações diferentes naquela região (mutantes individuais mostrados com cores diferentes abaixo).

A limitação de sítios de restrição em mutagénese por cassete pode ser superado utilizando reacção em cadeia da polimerase com oligonucleotídicos " primers ", de tal modo que um fragmento maior pode ser gerado, abrangendo dois locais de restrição convenientes. A amplificação exponencial em PCR produz um fragmento contendo a mutação desejada em quantidade suficiente para ser separado do plasmídeo original não mutado por eletroforese em gel , que pode então ser inserido no contexto original usando técnicas convencionais de biologia molecular recombinante. Existem muitas variações da mesma técnica. O método mais simples coloca o local de mutação em direção a uma das extremidades do fragmento, em que um dos dois oligonucleotídeos usados ​​para gerar o fragmento contém a mutação. Isso envolve uma única etapa de PCR, mas ainda tem o problema inerente de exigir um local de restrição adequado próximo ao local de mutação, a menos que um primer muito longo seja usado. Outras variações, portanto, empregam três ou quatro oligonucleotídeos, dois dos quais podem ser oligonucleotídeos não mutagênicos que cobrem dois locais de restrição convenientes e geram um fragmento que pode ser digerido e ligado em um plasmídeo, enquanto o oligonucleotídeo mutagênico pode ser complementar a um local dentro desse fragmento, bem longe de qualquer local de restrição conveniente. Estes métodos requerem múltiplas etapas de PCR de modo que o fragmento final a ser ligado possa conter a mutação desejada. O processo de design para gerar um fragmento com a mutação desejada e locais de restrição relevantes pode ser complicado. Ferramentas de software como SDM-Assist podem simplificar o processo.

Mutagênese de plasmídeo inteiro

Para manipulações de plasmídeo, outras técnicas de mutagênese dirigida ao local foram amplamente suplantadas por técnicas que são altamente eficientes, mas relativamente simples, fáceis de usar e comercialmente disponíveis como um kit. Um exemplo dessas técnicas é o método Quikchange, em que um par de iniciadores mutagênicos complementares é usado para amplificar todo o plasmídeo em uma reação de termociclagem usando uma DNA polimerase sem deslocamento de fita de alta fidelidade, como a polimerase pfu . A reação gera um DNA circular cortado . O DNA molde deve ser eliminado por digestão enzimática com uma enzima de restrição , como Dpn I, que é específica para DNA metilado. Todo o DNA produzido a partir da maioria das cepas de Escherichia coli seria metilado; o plasmídeo molde que é biossintetizado em E. coli será, portanto, digerido, enquanto o plasmídeo mutado, que é gerado in vitro e, portanto, não metilado, seria deixado não digerido. Observe que, nesses métodos de mutagênese de plasmídeo de fita dupla, embora a reação de termociclagem possa ser usada, o DNA não precisa ser amplificado exponencialmente como em uma PCR. Em vez disso, a amplificação é linear e, portanto, é impreciso descrevê-los como um PCR, uma vez que não há reação em cadeia.

Observe que a polimerase pfu pode se deslocar no filamento em temperaturas de extensão mais altas (≥70 ° C), o que pode resultar no fracasso do experimento, portanto, a reação de extensão deve ser realizada na temperatura recomendada de 68 ° C. Em algumas aplicações, observou-se que este método leva à inserção de várias cópias de primers. Uma variação desse método, chamada SPRINP, evita esse artefato e tem sido usada em diferentes tipos de mutagênese dirigida ao local.

Outras técnicas, como a mutagênese de varredura de alvos dirigidos por oligo (SMOOT), podem combinar oligonucleotídeos mutagênicos de forma semi-aleatória na mutagênese de plasmídeo. Esta técnica pode criar bibliotecas de mutagênese de plasmídeo que variam de mutações simples a mutagênese de códon abrangente em um gene inteiro.

Métodos de mutagênese dirigida ao local in vivo

  • Delitto perfetto
  • Transposição "pop-in pop-out"
  • Deleção direta de genes e mutagênese específica do local com PCR e um marcador reciclável
  • Deleção direta do gene e mutagênese específica do local com PCR e um marcador reciclável usando regiões homólogas longas
  • Mutagênese dirigida ao local in vivo com oligonucleotídeos sintéticos

CRISPR

Desde 2013, o desenvolvimento da tecnologia CRISPR -Cas9 permitiu a introdução eficiente de várias mutações no genoma de uma ampla variedade de organismos. O método não requer um local de inserção do transposon, não deixa nenhum marcador e sua eficiência e simplicidade o tornaram o método preferido para edição do genoma .

Formulários

A mutagênese de saturação do local é um tipo de mutagênese direcionada ao local. Esta imagem mostra a mutagênese de saturação de uma única posição em uma proteína teórica de 10 resíduos. A versão de tipo selvagem da proteína é mostrada no topo, com M representando o primeiro aminoácido metionina e * representando o término da tradução. Todos os 19 mutantes da isoleucina na posição 5 são mostrados abaixo.

A mutagênese dirigida ao local é usada para gerar mutações que podem produzir uma proteína projetada racionalmente que tem propriedades aprimoradas ou especiais (isto é, engenharia de proteína).

Ferramentas investigativas - mutações específicas no DNA permitem que a função e as propriedades de uma sequência de DNA ou de uma proteína sejam investigadas de forma racional. Além disso, as alterações de um único aminoácido por mutagênese dirigida ao local em proteínas podem ajudar a compreender a importância das modificações pós-tradução. Por exemplo, mudar uma serina particular (fosfoacceptor) para uma alanina (fosfo-não aceitador) em uma proteína de substrato bloqueia a ligação de um grupo fosfato, permitindo assim que a fosforilação seja investigada. Esta abordagem foi usada para descobrir a fosforilação da proteína CBP pela quinase HIPK2. Outra abordagem abrangente é a mutagênese de saturação do local, onde um códon ou um conjunto de códons podem ser substituídos por todos os aminoácidos possíveis nas posições específicas.

Aplicações comerciais - as proteínas podem ser projetadas para produzir formas mutantes que são feitas sob medida para uma aplicação específica. Por exemplo, detergentes para a roupa comumente usados ​​podem conter subtilisina , cuja forma de tipo selvagem possui uma metionina que pode ser oxidada por alvejante, reduzindo significativamente a atividade da proteína no processo. Esta metionina pode ser substituída por alanina ou outros resíduos, tornando-a resistente à oxidação, mantendo assim a proteína ativa na presença de alvejante.

Síntese gênica

À medida que o custo da síntese de oligonucleotídeos de DNA cai, a síntese artificial de um gene completo é agora um método viável para a introdução de mutação no gene. Este método permite extensa mutagênese em múltiplos locais, incluindo o redesenho completo do uso do códon do gene para otimizá-lo para um organismo particular.

Veja também

Referências

links externos