Cristalização de proteínas - Protein crystallization

Cristais de proteínas cultivadas no ônibus espacial dos EUA ou na estação espacial russa , Mir .

A cristalização de proteínas é o processo de formação de um conjunto regular de moléculas de proteínas individuais estabilizadas por contatos de cristal. Se o cristal estiver suficientemente ordenado, ele difratará . Algumas proteínas formam matrizes cristalinas naturalmente, como a aquaporina no cristalino do olho.

No processo de cristalização das proteínas, as proteínas são dissolvidas em meio aquoso e em solução de amostra até atingirem o estado supersaturado . Diferentes métodos são usados ​​para atingir esse estado, como difusão de vapor, microbatch, microdiálise e difusão de interface livre. O desenvolvimento de cristais de proteína é um processo difícil influenciado por muitos fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica na solução de cristalização e até mesmo a gravidade. Uma vez formados, esses cristais podem ser usados ​​em biologia estrutural para estudar a estrutura molecular da proteína, particularmente para vários fins industriais ou médicos.

Desenvolvimento da cristalização de proteínas

Por mais de 150 anos, os cientistas souberam da cristalização de moléculas de proteínas.

Em 1840, Friedrich Ludwig Hünefeld descobriu acidentalmente a formação de material cristalino em amostras de sangue de minhoca mantidas sob duas lâminas de vidro e ocasionalmente observou pequenos cristais em forma de placa em amostras dessecadas de sangue suíno ou humano. Esses cristais foram chamados de 'hemoglobina', por Felix Hoppe-Seyler em 1864. As descobertas seminais de Hünefeld inspiraram muitos cientistas no futuro.

Em 1851, Otto Funke descreveu o processo de produção de cristais de hemoglobina humana por meio da diluição de hemácias com solventes, como água pura, álcool ou éter, seguido de lenta evaporação do solvente da solução de proteína. Em 1871, William T. Preyer, professor da Universidade de Jena, publicou um livro intitulado Die Blutkrystalle (Os cristais de sangue), revisando as características dos cristais de hemoglobina de cerca de 50 espécies de mamíferos, pássaros, répteis e peixes.

Em 1909, o fisiologista Edward T. Reichert, junto com o mineralogista Amos P. Brown, publicou um tratado sobre a preparação, fisiologia e caracterização geométrica de cristais de hemoglobina de várias centenas de animais, incluindo espécies extintas como o lobo da Tasmânia. Cristais de proteína crescentes foram encontrados.

Em 1934, John Desmond Bernal e sua aluna Dorothy Hodgkin descobriram que os cristais de proteína cercados por seu licor-mãe davam melhores padrões de difração do que os cristais secos. Usando pepsina , eles foram os primeiros a discernir o padrão de difração de uma proteína globular úmida. Antes de Bernal e Hodgkin, a cristalografia de proteínas era realizada apenas em condições secas, com resultados inconsistentes e não confiáveis. Este é o primeiro padrão de difração de raios-X de um cristal de proteína.

Em 1958, a estrutura da mioglobina (uma proteína vermelha contendo heme), determinada por cristalografia de raios X, foi relatada pela primeira vez por John Kendrew . Kendrew compartilhou o Prêmio Nobel de Química de 1962 com Max Perutz por esta descoberta.

Agora, com base nos cristais de proteína, as estruturas deles desempenham um papel significativo na bioquímica e na medicina translacional.

O básico da cristalização de proteínas

Cristais de lisozima observados através de filtro polarizador.

A teoria da cristalização de proteínas

O essencial da formação de cristais é permitir que a solução da amostra atinja o estado supersaturado. A supersaturação é definida por McPherson et al. 2014 como "uma condição de não equilíbrio em que alguma quantidade da macromolécula em excesso do limite de solubilidade, sob condições químicas e físicas específicas, está, no entanto, presente na solução." A formação de sólidos em solução, como agregação e cristais, favorece o restabelecimento do equilíbrio. O sistema deseja restabelecer o equilíbrio para que cada componente na expressão de energia seja mínimo. Existem três fatores principais envolvidos na expressão de energia, que são entalpia (∆H), entropia (∆S) e temperatura (T). ∆H nesta expressão refere-se ao ∆H das ligações químicas sendo formadas e quebradas em reações ou mudanças de fase. ∆S refere-se ao grau de liberdade ou à medição da incerteza que as moléculas podem ter. A espontaneidade de um processo, a energia livre de Gibb (∆G), é definida como ∆G = ∆H-T∆S. Assim, tanto o aumento de ∆S quanto a diminuição de ∆H contribuem para a espontaneidade do processo como um todo, tornando ∆G mais negativo, atingindo assim uma condição mínima de energia do sistema. Quando os cristais se formam, as moléculas de proteína tornam-se mais ordenadas, o que leva a uma diminuição em ∆S e torna ∆G mais positivo. Portanto, a cristalização espontânea requer um ∆H suficientemente negativo para superar a perda de entropia do sistema mais ordenado.

Uma visão molecular indo da solução ao cristal

A formação de cristais requer duas etapas: nucleação e crescimento. A nucleação é a etapa de iniciação para a cristalização. Na fase de nucleação, as moléculas de proteína em solução se juntam como agregados para formar um núcleo sólido estável. À medida que o núcleo se forma, o cristal fica cada vez maior por moléculas que se ligam a esse núcleo estável. A etapa de nucleação é crítica para a formação de cristais, uma vez que é a transição de fase de primeira ordem das amostras que passam de um alto grau de liberdade para obter um estado ordenado (aquoso para sólido). Para que a etapa de nucleação seja bem-sucedida, a manipulação dos parâmetros de cristalização é essencial. A abordagem por trás da obtenção de uma proteína para cristalizar é produzir uma menor solubilidade da proteína-alvo em solução. Uma vez que o limite de solubilidade é excedido e cristais estão presentes, a cristalização é realizada.

Métodos de cristalização de proteínas

Difusão de vapor

Três métodos de preparação de cristais, A: Gota suspensa. B: Queda sentada. C: Microdiálise

A difusão de vapor é o método mais comumente empregado de cristalização de proteínas. Neste método, as gotículas contendo proteína purificada, tampão e precipitante são permitidos para equilibrar com um reservatório maior contendo tampões e precipitantes semelhantes em concentrações mais elevadas. Inicialmente, a gota de solução de proteína contém concentrações comparativamente baixas de precipitante e proteína, mas à medida que a gota e o reservatório se equilibram, as concentrações de precipitante e de proteína aumentam na queda. Se as soluções de cristalização apropriadas forem usadas para uma determinada proteína, o crescimento do cristal ocorre na gota. Este método é usado porque permite mudanças suaves e graduais na concentração de proteínas e na concentração de precipitantes, que auxiliam no crescimento de cristais grandes e bem ordenados.

A difusão de vapor pode ser realizada em formato de gota suspensa ou gota a gota. O aparelho de queda suspensa envolve uma gota de solução de proteína colocada em uma lamínula invertida, que é então suspensa acima do reservatório. O aparelho de cristalização em gota fixa coloca a gota em um pedestal separado do reservatório. Ambos os métodos requerem a vedação do ambiente para que o equilíbrio entre a gota e o reservatório possa ocorrer.

Microbatch

Um microbatch geralmente envolve a imersão de um volume muito pequeno de gotículas de proteína em óleo (tão pouco quanto 1 µl). A razão pela qual o óleo é necessário é porque esse baixo volume de solução de proteína é usado e, portanto, a evaporação deve ser inibida para realizar o experimento aquoso. Embora existam vários óleos que podem ser usados, os dois agentes de vedação mais comuns são óleos de parafina (descritos por Chayen et al.) E óleos de silício (descritos por D'Arcy). Existem também outros métodos de Microbatching que não usam um agente de vedação líquido e, em vez disso, exigem que um cientista coloque rapidamente um filme ou alguma fita em uma placa com poço após colocar a gota no poço.

Além das quantidades muito limitadas de amostra necessária, este método também tem como vantagem adicional que as amostras são protegidas de contaminação do ar, uma vez que nunca são expostas ao ar durante o experimento.

Microdiálise

A microdiálise tira proveito de uma membrana semipermeável, através da qual pequenas moléculas e íons podem passar, enquanto proteínas e grandes polímeros não podem se cruzar. Ao estabelecer um gradiente de concentração de soluto através da membrana e permitir que o sistema progrida em direção ao equilíbrio, o sistema pode mover-se lentamente em direção à supersaturação, ponto no qual os cristais de proteína podem se formar.

A microdiálise pode produzir cristais por salga, empregando altas concentrações de sal ou outros pequenos compostos permeáveis ​​à membrana que diminuem a solubilidade da proteína. Muito ocasionalmente, algumas proteínas podem ser cristalizadas por salinização de diálise, por diálise contra água pura, removendo solutos, conduzindo a autoassociação e cristalização.

Difusão de interface livre

Essa técnica reúne proteínas e soluções de precipitação sem pré-misturá-las, mas, em vez disso, injetá-las pelos lados de um canal, permitindo o equilíbrio por difusão. As duas soluções entram em contato em uma câmara de reagente, ambas em suas concentrações máximas, iniciando a nucleação espontânea. Conforme o sistema entra em equilíbrio, o nível de supersaturação diminui, favorecendo o crescimento do cristal.

Fatores que influenciam a cristalização de proteínas

pH

A força motriz básica para a cristalização de proteínas é otimizar o número de ligações que uma pessoa pode formar com outra proteína por meio de interações intermoleculares. Essas interações dependem das densidades eletrônicas das moléculas e das cadeias laterais das proteínas que mudam em função do pH. A estrutura terciária e quaternária das proteínas são determinadas por interações intermoleculares entre os grupos laterais dos aminoácidos, em que os grupos hidrofílicos estão geralmente voltados para fora, para a solução, para formar uma camada de hidratação para o solvente (água). Conforme o pH muda, a carga nesse grupo lateral polar também muda em relação ao pH da solução e ao pKa da proteína. Assim, a escolha do pH é essencial tanto para promover a formação de cristais onde a ligação entre as moléculas é mais favorável do que com as moléculas de água. O pH é uma das manipulações mais poderosas que se pode atribuir para a condição ideal de cristalização.

Temperatura

A temperatura é outro parâmetro interessante para discutir, uma vez que a solubilidade da proteína é uma função da temperatura. Na cristalização de proteínas, a manipulação da temperatura para produzir cristais bem-sucedidos é uma estratégia comum. Ao contrário do pH, a temperatura de diferentes componentes dos experimentos de cristalografia pode impactar os resultados finais, como temperatura de preparação do tampão, temperatura do experimento de cristalização real, etc.

Aditivos químicos

Os aditivos químicos são pequenos compostos químicos que são adicionados ao processo de cristalização para aumentar o rendimento dos cristais. O papel de pequenas moléculas na cristalização de proteínas não tinha sido bem pensado nos primeiros dias, uma vez que eram consideradas contaminantes na maioria dos casos. Moléculas menores cristalizam melhor do que macromoléculas, como proteínas, portanto, o uso de aditivos químicos havia sido limitado antes do estudo de McPherson. No entanto, este é um aspecto poderoso dos parâmetros experimentais para a cristalização que é importante para os bioquímicos e cristalógrafos investigarem e aplicarem mais profundamente.

Tecnologias que auxiliam na cristalização de proteínas

Triagem de cristalização de alto rendimento

Existem métodos de alto rendimento para ajudar a agilizar o grande número de experimentos necessários para explorar as várias condições que são necessárias para o crescimento bem-sucedido do cristal. Existem inúmeros kits comerciais disponíveis para encomenda, que aplicam ingredientes pré-montados em sistemas que garantem uma cristalização bem-sucedida. Usando esse kit, o cientista evita o incômodo de purificar uma proteína e determinar as condições de cristalização apropriadas.

Os robôs de manuseio de líquidos podem ser usados ​​para configurar e automatizar um grande número de experimentos de cristalização simultaneamente. O que de outra forma seria um processo lento e potencialmente sujeito a erros realizado por um ser humano pode ser realizado de forma eficiente e precisa com um sistema automatizado. Os sistemas de cristalização robótica usam os mesmos componentes descritos acima, mas realizam cada etapa do procedimento rapidamente e com um grande número de repetições. Cada experimento utiliza pequenas quantidades de solução, e a vantagem do tamanho menor é dupla: os tamanhos de amostra menores não apenas reduzem o gasto de proteína purificada, mas quantidades menores de solução levam a cristalizações mais rápidas. Cada experimento é monitorado por uma câmera que detecta o crescimento do cristal.

Engenharia de proteínas

As proteínas podem ser projetadas para melhorar a chance de cristalização bem-sucedida de proteínas usando técnicas como Redução de Entropia de Superfície ou engenharia em contatos de cristal. Freqüentemente, resíduos de cisteína problemáticos podem ser substituídos por alanina para evitar agregação mediada por dissulfeto , e resíduos como lisina, glutamato e glutamina podem ser alterados para alanina para reduzir a flexibilidade intrínseca da proteína, o que pode impedir a cristalização.

Aplicações da cristalografia de proteínas

Estruturas macromoleculares podem ser determinadas a partir do cristal de proteína usando uma variedade de métodos, incluindo difração de raios-X / cristalografia de raios-X , microscopia eletrônica criogênica (CryoEM) (incluindo cristalografia de elétrons e difração de elétrons microcristais (MicroED) ), raios-X de pequeno ângulo espalhamento e difração de nêutrons . Veja também Biologia Estrutural .

A cristalização de proteínas também pode ser útil na formulação de proteínas para fins farmacêuticos.

Veja também

Referências

links externos