Fosfolipase D - específica de N-acil fosfatidiletanolamina N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipase D ( NAPE-PLD ) é uma enzima que catalisa a liberação de N-aciletanolamina (NAE) a partir de N-acil-fosfatidiletanolamina (NAPE). Esta é uma parte importante do processo que converte lipídios comuns em sinais químicos como anandamida e oleoiletanolamina . Em humanos, a proteína NAPE-PLD é codificada pelo gene NAPEPLD .

Descoberta

NAPE-PLD é uma atividade enzimática - uma fosfolipase , que atua sobre os fosfolipídios encontrados na membrana celular . Não é homologia mas o resultado da sua actividade química que as classes de TI como fosfolipase D . A atividade enzimática foi descoberta e caracterizada em uma série de experimentos que culminaram na publicação em 2004 de um esquema de purificação bioquímica a partir do qual o sequenciamento de peptídeos poderia ser realizado. Os pesquisadores homogeneizaram (finamente triturados) corações de 150 ratos e submeteram o lisado bruto resultante à sedimentação de sacarose a 105.000 xg para separar as membranas celulares do restante da célula. As proteínas integrais da membrana foram então solubilizadas usando octil glucosídeo e submetidas a quatro etapas de cromatografia em coluna (coluna de troca catiônica HiTrap SP HP, coluna de troca aniônica HiTrap Q, coluna de afinidade HiTrap Blue, coluna de hidroxiapatita Bio-Gel HTP). Cada um deles separa os diferentes tipos de proteínas de membrana em diferentes recipientes de amostra quando as proteínas são eluídas da coluna ao longo do tempo e, medindo a atividade das amostras em cada recipiente, foi possível rastrear quais receberam a enzima ativa. A medição da atividade enzimática foi feita por cromatografia em camada delgada de um substrato radioativo sensível à atividade enzimática NAPE-PLD: Clivagem do substrato afetada onde apareceu na placa quando a radiação foi detectada em um analisador de bioimagem.

O resultado deste extenso procedimento ainda não foi uma proteína pura, mas produziu um número limitado de bandas por SDS-PAGE , e uma banda de 46 quilodaltons foi encontrada para correlacionar em intensidade com a atividade enzimática. Esta banda foi cortada do gel e digerida com tripsina , e os seus péptidos foram separados uns dos outros por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa . Os fragmentos resultantes foram então microsequenciados por uma degradação automática de Edman . Três corresponderam à vimentina , uma proteína de filamento intermediário de 56 kDa que se acredita ser um contaminante, e os outros dois corresponderam ao clone de cDNA subsequentemente identificado como NAPE-PLD.

Uma vez obtida essa pista, a identificação poderia ser confirmada por um procedimento menos oneroso: A superexpressão do cDNA putativo NAPE-PLD em células COS-7 rendeu uma forte atividade enzimática NAPE-PLD, cujas características se mostraram semelhantes às de o extrato de coração original.

Características

A sequência de cDNA do NAPEPLD prevê 396 sequências de aminoácidos em camundongos e ratos, que são 89% e 90% idênticas às de humanos. Verificou-se que NAPE-PLD não tem homologia com os genes da fosfolipase D conhecidos , mas pode ser classificado por homologia para cair na família da metalohidrolase de zinco da dobra da beta-lactamase . Em particular, o motivo altamente conservado H X ( E / H ) X D ( C / R / S / H ) X _50–70 H X _15–30 ( C / S / D ) X _30–70 H foi observado, que está, em geral, associada à ligação do zinco e à reação de hidrólise nessa classe de proteínas, levando os autores a propor que a atividade deve ser correlacionada com o teor de zinco.

Quando recombinante NAPE-PLD foi testado em células COS in vitro, que tinha uma actividade semelhante para vários radiomarcados substratos: N-palmitoylphosphatidylethanolamine, N-arachidonoylphosphatidylethanolamine, N-oleoylphosphatidylethanolamine, e N-stearoylphosphatidylethanolamine todos feitos reagir com um K _m entre 2-4 micromolar e um V _max entre 73 e 101 nanomoles por miligrama por minuto, conforme calculado pelo gráfico Lineweaver-Burk . (Estes geram N- palmitoiletanolamina , anandamida , N- oleoiletanolamina e N-estearoiletanolamina, respectivamente) A enzima também reagiu com N-palmitoil-liso-fosfatidiletanolamina e N-araquidonoil-liso-fosfatidiletanolamina com K _m semelhante, mas a um terço de -quarto do V _max . Essas atividades são consistentes com a observação de que muitos tecidos produzem uma variedade de N- acetanolaminas .

No entanto, o NAPE-PLD não tinha capacidade para produzir ácido fosfatídico detectável a partir de fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina como é catalisado por outras enzimas fosfolipase D. Também carece da atividade de transfosfatidilação da fosfolipase D, que permite a criação de álcoois fosfatidílicos em vez de ácido fosfatídico na presença de etanol ou butanol .

Caminho

Essa enzima atua como a segunda etapa de uma via bioquímica iniciada pela criação da N-acilfosfatidiletanolamina , por meio da transferência de um grupo acila da posição sn -1 do glicerofosfolipídeo para o grupo amino da fosfatidiletanolamina . Embora a NAPE-PLD contribua para a biossíntese de vários NAEs no sistema nervoso central de mamíferos , não está claro se esta enzima não é responsável pela formação do endocanabinóide anandamida , uma vez que foi relatado que camundongos knockout para NAPE-PLD têm o tipo selvagem níveis ou níveis muito reduzidos de anandamida.

As N-aciletanolaminas liberadas por esta enzima tornam-se substratos potenciais para a amida hidrolase de ácidos graxos (FAAH), que hidrolisa os ácidos graxos livres da etanolamina . Defeitos nesta enzima podem fazer com que os produtos NAPE-PLD, como a anandamida, atinjam níveis 15 vezes maiores do que os normalmente observados.

Estrutura

Esta enzima de membrana forma homodímeros , parcialmente separados por um canal interno de ∼9 Å. A dobra da proteína metalo beta-lactamase é adaptada para se associar aos fosfolipídios da membrana . Uma cavidade hidrofóbica fornece uma via de entrada para o substrato NAPE no sítio ativo, onde um centro de zinco binuclear catalisa sua hidrólise. Os ácidos biliares se ligam com alta afinidade a bolsas seletivas nesta cavidade, aumentando a montagem do dímero e permitindo a catálise. O NAPE-PLD facilita a interferência entre os sinais do ácido biliar e os sinais da amida lipídica.

Referências