Mutagênese - Mutagenesis

Mutagénese / m ju t ə ɛ n ɪ s ɪ s / é um processo pelo qual a informação genética de um organismo é alterada pela produção de uma mutação . Pode ocorrer espontaneamente na natureza ou como resultado da exposição a agentes mutagênicos . Também pode ser alcançado experimentalmente usando procedimentos de laboratório. Um mutagênico é um agente causador de mutações, seja ele químico ou físico, que resulta em um aumento da taxa de mutações no código genético de um organismo. Na natureza, a mutagênese pode levar ao câncer e a várias doenças hereditárias , mas também é uma força motriz da evolução. A mutagênese como ciência foi desenvolvida a partir do trabalho de Hermann Muller , Charlotte Auerbach e JM Robson na primeira metade do século XX.

História

O DNA pode ser modificado, natural ou artificialmente, por uma série de agentes físicos, químicos e biológicos, resultando em mutações . Hermann Muller descobriu que "altas temperaturas" têm a capacidade de transformar genes no início da década de 1920 e, em 1927, demonstrou uma ligação causal à mutação ao experimentar uma máquina de raios-X , observando mudanças filogenéticas ao irradiar moscas-das-frutas com uma dose relativamente alta de Raios-x . Muller observou uma série de rearranjos cromossômicos em seus experimentos e sugeriu a mutação como causa do câncer. A associação de exposição à radiação e câncer foi observada já em 1902, seis anos após a descoberta do raio X por Wilhelm Röntgen , e a descoberta da radioatividade por Henri Becquerel . Lewis Stadler , contemporâneo de Muller, também mostrou o efeito dos raios X em mutações na cevada em 1928 e da radiação ultravioleta (UV) no milho em 1936. Em 1940, Charlotte Auerbach e JM Robson descobriram que o gás mostarda também pode causar mutações em moscas da fruta.

Embora as mudanças no cromossomo causadas por raios X e gás mostarda fossem prontamente observáveis ​​para os primeiros pesquisadores, outras mudanças no DNA induzidas por outros mutagênicos não eram tão facilmente observáveis; o mecanismo pelo qual ocorrem pode ser complexo e demorar mais para desvendar. Por exemplo, foi sugerido que a fuligem era a causa do câncer já em 1775, e o alcatrão de carvão demonstrou causar câncer em 1915. Os produtos químicos envolvidos em ambos foram mais tarde mostrados como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH). Os PAHs por si só não são cancerígenos, e foi proposto em 1950 que as formas cancerígenas dos PAHs são os óxidos produzidos como metabólitos a partir de processos celulares. O processo metabólico foi identificado na década de 1960 como catálise pelo citocromo P450 , que produz espécies reativas que podem interagir com o DNA para formar adutos , ou moléculas produto resultantes da reação do DNA e, no caso, o citocromo P450; o mecanismo pelo qual os adutos de PAH dão origem à mutação, entretanto, ainda está sob investigação.

Distinção entre uma mutação e dano ao DNA

O dano ao DNA é uma alteração anormal na estrutura do DNA que não pode, por si só, ser replicada quando o DNA se replica . Em contraste, uma mutação é uma mudança na sequência de ácido nucleico que pode ser replicada; portanto, uma mutação pode ser herdada de uma geração para a próxima. O dano pode ocorrer por adição química (aduto), ou ruptura estrutural de uma base de DNA (criando um nucleotídeo anormal ou fragmento de nucleotídeo), ou uma quebra em uma ou ambas as fitas de DNA. Esse dano ao DNA pode resultar em mutação. Quando o DNA contendo dano é replicado, uma base incorreta pode ser inserida na nova fita complementar à medida que ela está sendo sintetizada (ver reparo de DNA § Síntese de translesão ). A inserção incorreta na nova fita ocorrerá no lado oposto ao local danificado na fita modelo, e essa inserção incorreta pode se tornar uma mutação (ou seja, um par de bases alterado) na próxima rodada de replicação. Além disso, quebras de fita dupla no DNA podem ser reparadas por um processo de reparo impreciso, junção de extremidade não homóloga , que produz mutações. Normalmente, as mutações podem ser evitadas se os sistemas precisos de reparo do DNA reconhecerem os danos ao DNA e os repararem antes da conclusão da próxima rodada de replicação. Pelo menos 169 enzimas são diretamente empregadas no reparo do DNA ou influenciam os processos de reparo do DNA. Destes, 83 são empregados diretamente nos 5 tipos de processos de reparo de DNA indicados no gráfico mostrado no artigo Reparo de DNA .

O DNA nuclear de mamíferos pode sustentar mais de 60.000 episódios de danos por célula por dia, conforme listado com referências em danos ao DNA (que ocorrem naturalmente) . Se não forem corrigidos, esses adutos, após replicação incorreta nos locais danificados, podem dar origem a mutações. Na natureza, as mutações que surgem podem ser benéficas ou deletérias - esta é a força motriz da evolução. Um organismo pode adquirir novas características por meio de mutação genética, mas a mutação também pode resultar na função prejudicada dos genes e, em casos graves, pode causar a morte do organismo. A mutação também é uma fonte importante de aquisição de resistência a antibióticos em bactérias e a agentes antifúngicos em leveduras e bolores. Em um ambiente de laboratório, a mutagênese é uma técnica útil para gerar mutações que permite que as funções dos genes e produtos gênicos sejam examinados em detalhes, produzindo proteínas com características aprimoradas ou novas funções, bem como cepas mutantes com propriedades úteis. Inicialmente, a capacidade da radiação e dos mutagênicos químicos de causar mutação foi explorada para gerar mutações aleatórias, mas técnicas posteriores foram desenvolvidas para introduzir mutações específicas.

Em humanos, uma média de 60 novas mutações são transmitidas de pais para filhos. Os machos humanos, entretanto, tendem a transmitir mais mutações dependendo de sua idade, transmitindo uma média de duas novas mutações para sua progênie a cada ano adicional de sua idade.

Mecanismos

A mutagênese pode ocorrer endogenamente (por exemplo, hidrólise espontânea), por meio de processos celulares normais que podem gerar espécies reativas de oxigênio e adutos de DNA, ou por meio de erro na replicação e reparo do DNA. A mutagênese também pode ocorrer como resultado da presença de mutágenos ambientais que induzem alterações no DNA de um organismo. O mecanismo pelo qual a mutação ocorre varia de acordo com o mutagênico , ou agente causador, envolvido. A maioria dos mutagênicos atua direta ou indiretamente por meio de metabólitos mutagênicos no DNA de um organismo, produzindo lesões. Alguns mutagênicos, entretanto, podem afetar a replicação ou o mecanismo de partição cromossômica e outros processos celulares.

A mutagênese também pode ser auto-induzida por organismos unicelulares quando as condições ambientais são restritivas ao crescimento do organismo, como bactérias que crescem na presença de antibióticos, leveduras que crescem na presença de um agente antifúngico ou outros organismos unicelulares que crescem em um ambiente sem um nutriente essencial

Muitos mutagênicos químicos requerem ativação biológica para se tornarem mutagênicos. Um importante grupo de enzimas envolvidas na geração de metabólitos mutagênicos é o citocromo P450 . Outras enzimas que também podem produzir metabólitos mutagênicos incluem glutationa S-transferase e epóxido hidrolase microssomal . Mutágenos que não são mutagênicos por si próprios, mas requerem ativação biológica, são chamados de promutágenos.

Embora a maioria dos mutagênicos produza efeitos que resultam em erros na replicação, por exemplo, criando adutos que interferem na replicação, alguns mutagênicos podem afetar diretamente o processo de replicação ou reduzir sua fidelidade. O análogo de base, como o 5-bromouracil, pode substituir a timina na replicação. Metais como cádmio, cromo e níquel podem aumentar a mutagênese de várias maneiras, além de direcionar o dano ao DNA, por exemplo, reduzindo a capacidade de reparar erros, bem como produzir alterações epigenéticas.

As mutações geralmente surgem como resultado de problemas causados ​​por lesões de DNA durante a replicação, resultando em erros na replicação. Em bactérias, danos extensos ao DNA devido a mutagênicos resultam em lacunas de DNA de fita simples durante a replicação. Isso induz a resposta SOS , um processo de reparo de emergência que também é sujeito a erros, gerando mutações. Em células de mamíferos, a paralisação da replicação em locais danificados induz uma série de mecanismos de resgate que ajudam a contornar as lesões de DNA, no entanto, isso também pode resultar em erros. A família Y de DNA polimerases é especializada em bypass de lesão de DNA em um processo denominado síntese de translesão (TLS), pelo qual essas polimerases de bypass de lesão substituem a DNA polimerase replicativa de alta fidelidade paralisada, transitam pela lesão e estendem o DNA até que a lesão tenha passado. que a replicação normal pode ser retomada; esses processos podem estar sujeitos a erros ou isentos de erros.

Dano de DNA e mutação espontânea

O número de episódios de danos ao DNA que ocorrem em uma célula de mamífero por dia é alto (mais de 60.000 por dia). A ocorrência frequente de danos ao DNA é provavelmente um problema para todos os organismos que contêm DNA, e a necessidade de lidar com os danos ao DNA e minimizar seus efeitos deletérios é provavelmente um problema fundamental para a vida.

A maioria das mutações espontâneas provavelmente surgem da síntese de trans-lesão propensa a erros após um local de dano no DNA na fita modelo durante a replicação do DNA. Este processo pode superar bloqueios potencialmente letais, mas ao custo de introduzir imprecisões no DNA filho. A relação causal do dano ao DNA com a mutação espontânea é ilustrada pelo crescimento aeróbio da bactéria E. coli , em que 89% das mutações de substituição de base que ocorrem espontaneamente são causadas por danos ao DNA induzidos por espécies reativas de oxigênio (ROS). Na levedura, mais de 60% das substituições e deleções espontâneas de par de base única são provavelmente causadas pela síntese de trans-lesão.

Uma fonte adicional significativa de mutações em eucariotos é o processo de reparo de DNA impreciso de junção de extremidade não homóloga , que é frequentemente empregado no reparo de quebras de fita dupla.

Em geral, parece que a principal causa subjacente da mutação espontânea é a síntese trans-lesional propensa a erros durante a replicação do DNA e que a via de reparo de junção de extremidade não homóloga propensa a erros também pode ser um contribuidor importante em eucariotos.

Hidrólise espontânea

O DNA não é totalmente estável em solução aquosa e pode ocorrer a depurinação do DNA. Em condições fisiológicas, a ligação glicosídica pode ser hidrolisada espontaneamente e estima-se que 10.000 sítios de purina no DNA sejam depurinados a cada dia em uma célula. Existem numerosas vias de reparo de DNA para o DNA; entretanto, se o sítio apurínico não for reparado, pode ocorrer incorporação incorreta de nucleotídeos durante a replicação. A adenina é preferencialmente incorporada por DNA polimerases em um sítio apurínico .

A citidina também pode ser desaminada em uridina a um quinhentésimo da taxa de depurinação e pode resultar na transição de G para A. As células eucarióticas também contêm 5-metilcitosina , que se acredita estar envolvida no controle da transcrição do gene, que pode ser desaminado em timina.

Tautomerismo

A tautomerização é o processo pelo qual os compostos se reorganizam espontaneamente para assumir suas formas isoméricas estruturais . Por exemplo, as formas ceto (C = O) de guanina e timina podem se reorganizar em suas formas raras de enol (-OH), enquanto as formas amino (-NH 2 ) de adenina e citosina podem resultar no imino mais raro (= NH) formulários. Na replicação do DNA, a tautomerização altera os locais de emparelhamento de bases e pode causar o emparelhamento impróprio de bases de ácido nucleico.

Modificação de bases

As bases podem ser modificadas endogenamente por moléculas celulares normais. Por exemplo, o DNA pode ser metilado por S-adenosilmetionina , alterando assim a expressão do gene marcado sem incorrer em uma mutação na própria sequência de DNA. A modificação da histona é um processo relacionado no qual as proteínas histonas em torno das quais as bobinas de DNA podem ser modificadas de forma semelhante por meio de metilação, fosforilação ou acetilação; essas modificações podem atuar para alterar a expressão gênica do DNA local e também podem atuar para denotar localizações de DNA danificado que precisam de reparo. O DNA também pode ser glicosilado por açúcares redutores .

Muitos compostos, como PAHs, aminas aromáticas , aflatoxinas e alcalóides pirrolizidínicos , podem formar espécies reativas de oxigênio catalisadas pelo citocromo P450. Esses metabólitos formam adutos com o DNA, o que pode causar erros na replicação, e os adutos aromáticos volumosos podem formar intercalação estável entre as bases e bloquear a replicação. Os adutos também podem induzir mudanças conformacionais no DNA. Alguns adutos também podem resultar na depurinação do DNA; é, no entanto, incerto quão significativa é a depurinação causada pelos adutos na geração da mutação.

A alquilação e a arilação de bases podem causar erros na replicação. Alguns agentes alquilantes, como as N- nitrosaminas, podem exigir a reação catalítica do citocromo-P450 para a formação de um cátion alquil reativo. N 7 e O 6 da guanina e N 3 e N 7 da adenina são os mais suscetíveis ao ataque. Os adutos de N 7 -guanina formam a maior parte dos adutos de DNA , mas parecem não ser mutagênicos. A alquilação em O 6 de guanina, entretanto, é prejudicial porque o reparo por excisão do aduto de O 6 de guanina pode ser deficiente em alguns tecidos, como o cérebro. A metilação do O 6 da guanina pode resultar na transição de G para A , enquanto o O 4- metiltimina pode ser pareado incorretamente com a guanina. O tipo de mutação gerada, no entanto, pode ser dependente do tamanho e tipo do aduto, bem como da sequência de DNA.

A radiação ionizante e as espécies reativas de oxigênio freqüentemente oxidam a guanina para produzir 8-oxoguanina .

As setas indicam quebras cromossômicas devido a danos no DNA

Dano na espinha dorsal

A radiação ionizante pode produzir radicais livres altamente reativos que podem quebrar as ligações no DNA. As quebras de fita dupla são especialmente prejudiciais e difíceis de reparar, produzindo translocação e deleção de parte de um cromossomo. Agentes alquilantes como o gás mostarda também podem causar rupturas na estrutura do DNA. O estresse oxidativo também pode gerar espécies de oxigênio altamente reativas que podem danificar o DNA. O reparo incorreto de outros danos induzidos pelas espécies altamente reativas também pode levar a mutações.

Crosslinking

As ligações covalentes entre as bases dos nucleotídeos no DNA, sejam elas na mesma fita ou em fitas opostas, são referidas como reticulação de DNA ; a reticulação do DNA pode afetar a replicação e a transcrição do DNA e pode ser causada pela exposição a uma variedade de agentes. Alguns produtos químicos de ocorrência natural também podem promover a reticulação, como psoralenos após ativação por radiação UV e ácido nitroso. A reticulação entre cadeias (entre duas cadeias) causa mais danos, pois bloqueia a replicação e a transcrição e pode causar quebras e rearranjos cromossômicos. Alguns agentes de reticulação, como ciclofosfamida , mitomicina C e cisplatina, são usados ​​como quimioterápicos anticâncer devido ao seu alto grau de toxicidade para células em proliferação.

Dimerização

A dimerização consiste na ligação de dois monômeros para formar um oligômero, como a formação de dímeros de pirimidina em decorrência da exposição à radiação ultravioleta , que promove a formação de um anel ciclobutílico entre as tinas adjacentes no DNA. Nas células da pele humana, milhares de dímeros podem ser formados em um dia devido à exposição normal à luz solar. A DNA polimerase η pode ajudar a contornar essas lesões de uma maneira livre de erros; entretanto, os indivíduos com função de reparo do DNA defeituosa, como os que sofrem de xeroderma pigmentoso , são sensíveis à luz solar e podem ter tendência ao câncer de pele.

Etídio intercalado entre dois pares de bases adenina-timina.

Intercalação entre bases

A estrutura plana de produtos químicos como brometo de etídio e proflavina permite que eles se insiram entre bases no DNA. Essa inserção faz com que a espinha dorsal do DNA se estique e torna o deslizamento no DNA durante a replicação mais provável de ocorrer, uma vez que a ligação entre os fios se torna menos estável pelo alongamento. O deslizamento para frente resultará em mutação de exclusão , enquanto o deslizamento reverso resultará em uma mutação de inserção . Além disso, a intercalação em DNA de antraciclinas , como daunorrubicina e doxorrubicina, interfere no funcionamento da enzima topoisomerase II , bloqueando a replicação e causando recombinação homóloga mitótica.

Mutagênese de inserção

Os transposons e os vírus podem inserir sequências de DNA em regiões codificantes ou elementos funcionais de um gene e resultar na inativação do gene.

Mecanismos de mutagênese adaptativa

A mutagênese adaptativa foi definida como mecanismos de mutagênese que permitem que um organismo se adapte a um estresse ambiental. Como a variedade de estresses ambientais é muito ampla, os mecanismos que a possibilitam também são bastante amplos, pelo que as pesquisas na área têm mostrado. Por exemplo, em bactérias, embora a modulação da resposta SOS e a síntese de DNA de profago endógeno tenham mostrado aumentar a resistência de Acinetobacter baumannii à ciprofloxacina. Presume-se que os mecanismos de resistência estejam ligados à mutação cromossômica intransferível por transferência horizontal de genes em alguns membros da família Enterobacteriaceae, como E. coli, Salmonella spp., Klebsiella spp. E Enterobacter spp. Os eventos cromossômicos, principalmente a amplificação gênica, também parecem ser relevantes para essa mutagênese adaptativa em bactérias.

A pesquisa em células eucarióticas é muito mais escassa, mas eventos cromossômicos também parecem ser bastante relevantes: embora uma recombinação intracromossômica ectópica tenha sido relatada como estando envolvida na aquisição de resistência a 5-fluorocitosina em Saccharomyces cerevisiae , duplicações de genoma foram encontradas para conferir resistência em S. cerevisiae para ambientes pobres em nutrientes.

Aplicações de Laboratório

No laboratório, a mutagênese é uma técnica pela qual as mutações de DNA são deliberadamente projetadas para produzir genes, proteínas ou cepas de organismos mutantes. Vários constituintes de um gene, como seus elementos de controle e seu produto gênico, podem ser mutados para que a função de um gene ou proteína possa ser examinada em detalhes. A mutação também pode produzir proteínas mutantes com propriedades alteradas ou funções aprimoradas ou novas que podem ser úteis comercialmente. Cepas mutantes de organismos que têm aplicações práticas, ou permitem que a base molecular de uma função celular particular seja investigada, também podem ser produzidas.

Os primeiros métodos de mutagênese produziram mutações inteiramente aleatórias; no entanto, os métodos modernos de mutagênese são capazes de produzir mutações específicas do local . As técnicas de laboratório modernas usadas para gerar essas mutações incluem:

Veja também

Referências