Microdissecção de captura a laser - Laser capture microdissection
A microdissecção de captura a laser ( LCM ), também chamada de microdissecção , microdissecção a laser ( LMD ) ou microdissecção assistida por laser ( LMD ou LAM ), é um método para isolar células específicas de interesse de regiões microscópicas de tecido / células / organismos ( dissecção em um escala microscópica com a ajuda de um laser ).
Princípio
A microdissecção por captura a laser (LCM) é um método para obter subpopulações de células de tecido sob visualização microscópica direta. A tecnologia LCM pode colher as células de interesse diretamente ou pode isolar células específicas cortando células indesejadas para dar populações de células enriquecidas histologicamente puras. Existe uma variedade de aplicações downstream: genotipagem de DNA e análise de perda de heterozigosidade (LOH), perfil de transcrição de RNA , geração de biblioteca de cDNA , descoberta de proteômica e perfil de via de sinal. O tempo total necessário para realizar este protocolo é normalmente de 1–1,5 h.
Extração
Um laser é acoplado a um microscópio e se concentra no tecido da lâmina. Pelo movimento do laser pela ótica ou pelo palco, o foco segue uma trajetória predefinida pelo usuário. Essa trajetória, também chamada de elemento , é então recortada e separada do tecido adjacente. Após o processo de corte, um processo de extração deve seguir se um processo de extração for desejado. As tecnologias mais recentes utilizam microdissecção sem contato.
Existem várias maneiras de extrair tecido de uma lâmina de microscópio com uma amostra histopatológica . Pressione uma superfície pegajosa sobre a amostra e rasgue. Isso extrai a região desejada, mas também pode remover partículas ou tecidos indesejados da superfície, pois a superfície não é seletiva. Derreta uma membrana de plástico na amostra e rasgue. O calor é introduzido, por exemplo, por um laser vermelho ou infravermelho (IR) em uma membrana manchada com um corante absorvente. Como isso adere a amostra desejada na membrana, como acontece com qualquer membrana que é colocada perto da superfície da amostra histopatológica, pode haver alguns resíduos extraídos. Outro perigo é o calor introduzido: algumas moléculas como DNA, RNA ou proteína não permitem ser aquecidas demais ou de forma alguma com o objetivo de serem isoladas o mais puramente possível.
Para transporte sem contato. Existem três abordagens diferentes. Transporte por gravidade usando um microscópio vertical (denominado GAM, microdissecção assistida por gravidade ) ou transporte por catapulta de pressão a laser ; a geração mais recente utiliza uma tecnologia baseada em transferência direta induzida por laser (LIFT). Com o corte e a captura, uma tampa revestida com um adesivo é posicionada diretamente na seção de tecido de corte fino (5-8 μm), a própria seção repousando sobre uma membrana fina (polietileno naftaleno). Um laser IR aquece suavemente o adesivo na tampa, fundindo-o ao tecido subjacente e um laser UV corta o tecido e a membrana subjacente. A entidade de tecido de membrana agora adere à tampa e as células da tampa podem ser usadas em aplicações posteriores (DNA, RNA, análise de proteínas).
Procedimento
Sob um microscópio usando uma interface de software, uma seção de tecido (normalmente 5-50 micrômetros de espessura) é visualizada e células individuais ou grupos de células são identificados manualmente ou de maneiras semi-automatizadas ou mais totalmente automatizadas, permitindo a imagem e, em seguida, a seleção automática de alvos para isolamento. Atualmente, existem seis tecnologias primárias de isolamento / coleta usando um microscópio e um dispositivo para isolamento de células. Quatro deles normalmente usam um laser pulsado ultravioleta (355 nm) para o corte dos tecidos diretamente ou das membranas / filme e, às vezes, em combinação com um laser IR responsável por aquecer / derreter um polímero pegajoso para adesão e isolamento celular. O laser infravermelho oferece uma abordagem mais suave para a microdissecção. Uma quinta tecnologia baseada em laser ultravioleta usa lâminas especiais revestidas com um revestimento de transferência de energia que, quando ativado pelo pulso de laser, impulsiona o tecido ou células em uma tampa de coleta.
A largura de corte do laser é geralmente inferior a 1 µm, portanto, as células-alvo não são afetadas pelo feixe de laser. Mesmo as células vivas não são danificadas pelo corte a laser e são viáveis após o corte para clonagem e recultura conforme apropriado.
As várias tecnologias diferem no processo de recolha, possíveis métodos de imagem ( microscopia de fluorescência / microscopia de campo brilhante / microscopia de contraste de interferência diferencial / microscopia de contraste de fase / etc.) e os tipos de suportes e a preparação do tecido necessários antes da imagiologia e isolamento. A maioria é principalmente sistemas dedicados de microdissecção e alguns podem ser usados como microscópios de pesquisa também, apenas uma tecnologia (# 2 aqui, Leica) usa um microscópio vertical, limitando um pouco algumas das capacidades de manuseio de amostras, especialmente para trabalho com células vivas.
A primeira tecnologia (usada pela Carl Zeiss PALM) corta a amostra e a coleta por uma tecnologia de "catapulta". A amostra pode ser catapultada de uma lâmina ou prato de cultura especial por um pulso de laser UV desfocado que gera uma força fotônica para impulsionar o material para fora da lâmina / prato, uma técnica às vezes chamada Catapulta por Pressão de Micro-dissecção a Laser (LMPC). O material dissecado é enviado para cima (até vários milímetros) para uma tampa de tubo de microcentrífuga ou outro coletor que contém um tampão ou um material pegajoso especializado na tampa do tubo ao qual o tecido irá aderir. Este processo de catapulta ativa evita alguns dos problemas estáticos ao usar lâminas revestidas de membrana.
Outro processo segue o método de microdissecção assistida por gravidade que ativa a gravidade para coletar amostras na tampa do tubo sob a lâmina usada (usada pelo sistema ION LMD , Jungwoo F&B). No caso desse sistema, ele movimenta o palco motorizado para cortar as células de interesse, mantendo o feixe de laser fixo. E o sistema usa um laser de estado sólido de 355 nm ( UV-A ), que é a maneira mais segura de cortar os tecidos sem danos de RNA ou DNA.
Outro processo LCM intimamente relacionado (usado pela Leica) corta a amostra de cima e a amostra cai por gravidade (microdissecção assistida por gravidade) em um dispositivo de captura abaixo da amostra. O ponto diferente do superior é que o feixe de laser aqui está se movendo para cortar o tecido, movendo o espelho dicróico.
Quando as células (em uma lâmina ou prato de cultura especial) de escolha estão no centro do campo de visão, o operador seleciona as células de interesse usando o software do instrumento. A área a ser isolada quando um laser infravermelho próximo ativa o filme de transferência em uma tampa colocada na amostra de tecido, derretendo o adesivo que então funde o filme com as células subjacentes de escolha (ver sistemas Arcturus); e / ou ativando um laser UV para cortar a célula de interesse. As células são então retiradas da fina seção de tecido, deixando para trás todas as células indesejadas. As células de interesse são então visualizadas e documentadas antes da extração.
A quarta tecnologia baseada em UV (usada por Molecular Machines and Industries AG) oferece uma ligeira diferença para a terceira tecnologia aqui, essencialmente criando um tipo de sanduíche com lâmina> amostra> e membrana cobrindo a amostra pelo uso de uma lâmina de quadro cuja superfície de membrana é cortado pelo laser e, finalmente, recolhido por uma tampa adesiva especial.
Uma quinta tecnologia baseada em UV usa lâminas de vidro padrão revestidas com um revestimento de transferência de energia inerte e um sistema de microdissecção a laser baseado em UV (normalmente uma máquina Leica LMD ou PALM Zeiss). As seções de tecido são montadas no topo do revestimento de transferência de energia. A energia de um laser UV é convertida em energia cinética ao atingir o revestimento, vaporizando-o, impulsionando instantaneamente características de tecido selecionadas para o tubo de coleta. As lâminas revestidas de transferência de energia, comercializadas sob o nome comercial de lâminas DIRECTOR por Expression Pathology Inc. (Rockville, MD), oferecem várias vantagens para o trabalho proteômico. Eles também não têm autofluorescência, portanto podem ser usados para aplicações que usam manchas fluorescentes, DIC ou luz polarizada.
Além das seções de tecido, a LCM pode ser realizada em células / organismos vivos, esfregaços de células, preparações de cromossomos e tecido vegetal.
Formulários
O processo de microdissecção de captura a laser não altera ou danifica a morfologia e a química da amostra coletada, nem as células vizinhas. Por esta razão, LCM é um método útil de coleta de células selecionadas para análises de DNA , RNA e / ou proteínas . LCM também tem sido usado para isolar estruturas acelulares, como placas amilóides . A LCM pode ser realizada em uma variedade de amostras de tecido , incluindo esfregaços de sangue , preparações citológicas, culturas de células e alíquotas de tecido sólido. Tecido de arquivo congelado e embebido em parafina também pode ser usado.
Referências
links externos
- East Carolina University: LCM for "Dummies"
- Projeto do Atlas transcricional de Yale Rice que emprega microdissecção de captura a laser