Histologia - Histology

Espécime histológico sendo colocado no palco de um microscópio óptico .
Tecido pulmonar humano corado com hematoxilina e eosina , visto ao microscópio.

A histologia , também conhecida como anatomia microscópica ou microanatomia , é o ramo da biologia que estuda a anatomia microscópica dos tecidos biológicos . A histologia é a contrapartida microscópica da anatomia macroscópica , que olha para estruturas maiores visíveis sem um microscópio . Embora se possa dividir a anatomia microscópica em organologia , o estudo dos órgãos, a histologia , o estudo dos tecidos e a citologia , o estudo das células , o uso moderno coloca todos esses tópicos no campo da histologia. Na medicina , a histopatologia é o ramo da histologia que inclui a identificação microscópica e o estudo do tecido doente. No campo da paleontologia , o termo paleohistologia se refere à histologia de organismos fósseis .

Tecidos biológicos

Classificação de tecido animal

Existem quatro tipos básicos de tecidos animais: tecido muscular , tecido nervoso , tecido conjuntivo e tecido epitelial . Todos os tecidos animais são considerados subtipos desses quatro tipos principais de tecido (por exemplo, o sangue é classificado como tecido conjuntivo, uma vez que as células sanguíneas estão suspensas em uma matriz extracelular , o plasma ).

Classificação do tecido vegetal

Seção histológica de um caule de planta ( Alliaria petiolata ).

Para as plantas, o estudo de seus tecidos se enquadra no campo da anatomia vegetal , com os seguintes quatro tipos principais:

Histologia médica

Histopatologia é o ramo da histologia que inclui a identificação microscópica e o estudo do tecido doente. É uma parte importante da patologia anatômica e da patologia cirúrgica , pois o diagnóstico preciso do câncer e de outras doenças geralmente requer o exame histopatológico de amostras de tecido. Médicos treinados, patologistas frequentemente licenciados , realizam exames histopatológicos e fornecem informações diagnósticas com base em suas observações.

Ocupações

O campo da histologia que inclui a preparação de tecidos para exame microscópico é conhecido como histotecnologia. Os cargos do pessoal treinado que prepara amostras histológicas para exame são numerosos e incluem histotécnicos, histotecnologistas, técnicos e tecnólogos de histologia, técnicos de laboratório médico e cientistas biomédicos .

Preparação de amostra

A maioria das amostras histológicas precisa ser preparada antes da observação microscópica; esses métodos dependem da amostra e do método de observação.

Fixação

Seção histológica de um invertebrado fossilizado. Briozoário ordoviciano .

Os fixadores químicos são usados ​​para preservar e manter a estrutura dos tecidos e células; a fixação também endurece os tecidos, o que ajuda a cortar as finas seções de tecido necessárias para observação ao microscópio. Os fixadores geralmente preservam os tecidos (e células) por meio de proteínas de ligação cruzada irreversível. O fixador mais amplamente usado para microscopia de luz é a formalina tamponada neutra a 10% ou NBF ( formaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato ).

Para microscopia eletrônica, o fixador mais comumente usado é o glutaraldeído , geralmente como uma solução a 2,5% em solução salina tamponada com fosfato . Outros fixadores usados ​​para microscopia eletrônica são tetróxido de ósmio ou acetato de uranila .

A principal ação desses fixadores de aldeído é a reticulação de grupos amino em proteínas por meio da formação de pontes de metileno (-CH 2 -), no caso do formaldeído, ou por reticulações C 5 H 10 , no caso do glutaraldeído. Este processo, ao mesmo tempo que preserva a integridade estrutural das células e tecidos, pode danificar a funcionalidade biológica das proteínas, principalmente das enzimas .

A fixação com formalina leva à degradação de mRNA, miRNA e DNA, bem como à desnaturação e modificação de proteínas nos tecidos. No entanto, a extração e análise de ácidos nucléicos e proteínas de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina são possíveis usando protocolos apropriados.

Seleção e corte

Itens usados ​​para enviar as amostras: embalagem (biópsia), esponja (biópsia), cassete (processamento de tecido) e bolsa (biópsia).

A seleção é a escolha do tecido relevante nos casos em que não é necessário submeter toda a massa de tecido original a um processamento posterior. O restante pode permanecer fixado caso precise ser examinado posteriormente.

Aparar é o corte de amostras de tecido para expor as superfícies relevantes para um corte posterior. Também cria amostras de tecido de tamanho apropriado para caber em cassetes.

Embedding

Os tecidos são incorporados em um meio mais duro, tanto como suporte quanto para permitir o corte de fatias finas de tecido. Em geral, a água deve primeiro ser removida dos tecidos (desidratação) e substituída por um meio que solidifica diretamente ou por um fluido intermediário (clareamento) que é miscível com a mídia de inclusão.

Cera de parafina

Amostra histológica sendo embebida em cera de parafina (o tecido é mantido no fundo de um molde de metal e mais parafina derretida é derramada sobre ele para preenchê-lo).

Para microscopia de luz, a cera de parafina é o material de inclusão mais usado. A parafina é imiscível com água, o principal constituinte do tecido biológico, portanto, deve primeiro ser removida em uma série de etapas de desidratação. As amostras são transferidas através de uma série de banhos de etanol progressivamente mais concentrados , até etanol 100% para remover vestígios de água remanescentes. A desidratação é seguida por um agente de limpeza (normalmente xileno, embora outros substitutos ambientalmente seguros estejam em uso) que remove o álcool e é miscível com a cera; finalmente, a cera de parafina derretida é adicionada para substituir o xileno e infiltrar o tecido. Na maioria dos laboratórios de histologia ou histopatologia, a desidratação, clareamento e infiltração de cera são realizados em processadores de tecido que automatizam esse processo. Uma vez infiltrados na parafina, os tecidos são orientados em moldes que são preenchidos com cera; uma vez posicionada, a cera é resfriada, solidificando o bloco e o tecido.

Outros materiais

A cera de parafina nem sempre fornece uma matriz suficientemente dura para cortar seções muito finas (que são especialmente importantes para microscopia eletrônica). A cera de parafina também pode ser muito mole em relação ao tecido, o calor da cera derretida pode alterar o tecido de maneiras indesejáveis ​​ou os desidratantes ou desidratantes químicos podem danificar o tecido. As alternativas à cera de parafina incluem epóxi , acrílico , ágar , gelatina , celoidina e outros tipos de ceras.

Em microscopia eletrônica, as resinas epóxi são os meios de incorporação mais comumente empregados, mas as resinas acrílicas também são utilizadas, principalmente quando a imuno - histoquímica é necessária.

Para que os tecidos sejam cortados congelados, os tecidos são colocados em um meio de inclusão à base de água. Os tecidos pré-congelados são colocados em moldes com o material de inclusão líquido, geralmente um glicol à base de água, OCT , TBS , Cryogel ou resina, que é então congelado para formar blocos endurecidos.

Seccionando

Amostra histológica sendo cortada em um micrótomo.

Para microscopia de luz, uma faca montada em um micrótomo é usada para cortar seções de tecido (normalmente entre 5-15 micrômetros de espessura) que são montadas em uma lâmina de microscópio de vidro . Para microscopia eletrônica de transmissão (TEM), uma faca de diamante ou vidro montada em um ultramicrótomo é usada para cortar entre 50-150 nanômetros de espessura de seções de tecido.

Coloração

O tecido biológico tem pouco contraste inerente ao microscópio óptico ou eletrônico. A coloração é utilizada para dar contraste ao tecido, bem como destacar características particulares de interesse. Quando a coloração é usada para atingir um componente químico específico do tecido (e não a estrutura geral), o termo histoquímica é usado.

Luz do microscópio

Coloração tricrômica de Masson em traqueia de rato .

Hematoxilina e eosina ( coloração H&E ) é uma das colorações mais comumente utilizadas em histologia para mostrar a estrutura geral do tecido. A hematoxilina cora os núcleos das células de azul; eosina, um corante ácido , mancha o citoplasma e outros tecidos em diferentes manchas de rosa.

Em contraste com o H&E, que é usado como um corante geral, existem muitas técnicas que coram células, componentes celulares e substâncias específicas de forma mais seletiva. Uma técnica histoquímica comumente realizada que visa um produto químico específico é a reação do azul da Prússia de Perls , usada para demonstrar depósitos de ferro em doenças como a hemocromatose . O método de Nissl para a substância de Nissl e o método de Golgi (e manchas de prata relacionadas ) são úteis na identificação de neurônios são outros exemplos de manchas mais específicas.

Historadiografia

Na historadiografia , uma lâmina (às vezes tingida histoquimicamente) é radiografada. Mais comumente, a autorradiografia é usada na visualização dos locais para os quais uma substância radioativa foi transportada dentro do corpo, como células na fase S (passando por replicação de DNA ) que incorporam timidina tritiada ou locais aos quais as sondas de ácido nucleico radiomarcadas se ligam in situ hibridização . Para a autorradiografia em nível microscópico, a lâmina é tipicamente mergulhada em emulsão do trato nuclear líquido, que seca para formar o filme de exposição. Os grãos de prata individuais no filme são visualizados com microscopia de campo escuro .

Imunohistoquímica

Recentemente, os anticorpos foram usados ​​para visualizar especificamente proteínas, carboidratos e lipídios. Esse processo é denominado imunohistoquímica , ou quando a coloração é uma molécula fluorescente , imunofluorescência . Essa técnica aumentou muito a capacidade de identificar categorias de células ao microscópio. Outras técnicas avançadas, como hibridização in situ não radioativa , podem ser combinadas com imunoquímica para identificar moléculas de DNA ou RNA específicas com sondas fluorescentes ou marcadores que podem ser usados ​​para imunofluorescência e amplificação de fluorescência ligada a enzima (especialmente fosfatase alcalina e amplificação de sinal de tiramida). A microscopia de fluorescência e a microscopia confocal são usadas para detectar sinais fluorescentes com bons detalhes intracelulares.

Microscópio eletrônico

Para microscopia eletrônica, metais pesados são normalmente usados ​​para colorir seções de tecido. Acetato de uranila e citrato de chumbo são comumente usados ​​para conferir contraste ao tecido no microscópio eletrônico.

Técnicas especializadas

Criosseccionamento

Semelhante ao procedimento de seção congelada empregado na medicina, a criossecção é um método para congelar, cortar e montar rapidamente seções de tecido para histologia. O tecido geralmente é seccionado em um criostato ou micrótomo de congelamento. As seções congeladas são montadas em uma lâmina de vidro e podem ser tingidas para aumentar o contraste entre os diferentes tecidos. As seções congeladas não fixadas podem ser usadas para estudos que requerem a localização da enzima em tecidos e células. A fixação do tecido é necessária para certos procedimentos, como a coloração por imunofluorescência ligada a anticorpos . As seções congeladas são frequentemente preparadas durante a remoção cirúrgica de tumores para permitir a rápida identificação das margens do tumor, como na cirurgia de Mohs , ou determinação da malignidade do tumor, quando um tumor é descoberto acidentalmente durante a cirurgia.

Ultramicrotomia

Ultramicrotomia é um método de preparação de seções extremamente finas para análise por microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Os tecidos são comumente incorporados em epóxi ou outra resina plástica. Seções muito finas (menos de 0,1 micrômetro de espessura) são cortadas usando diamantes ou facas de vidro em um ultramicrótomo .

Artefatos

Artefatos são estruturas ou características do tecido que interferem no exame histológico normal. Os artefatos interferem na histologia alterando a aparência dos tecidos e ocultando estruturas. Os artefatos de processamento de tecido podem incluir pigmentos formados por fixadores, encolhimento, lavagem de componentes celulares, mudanças de cor em diferentes tipos de tecidos e alterações das estruturas no tecido. Um exemplo é o pigmento de mercúrio deixado para trás após o uso do fixador Zenker para consertar uma seção. A fixação com formalina também pode deixar um pigmento marrom a preto sob condições ácidas.

História

Santiago Ramón y Cajal em seu laboratório.

No século 17, o italiano Marcello Malpighi usava microscópios para estudar minúsculas entidades biológicas; alguns o consideram o fundador dos campos da histologia e da patologia microscópica. Malpighi analisou várias partes dos órgãos de morcegos, sapos e outros animais ao microscópio. Enquanto estudava a estrutura do pulmão, Malpighi percebeu seus alvéolos membranosos e as conexões em forma de cabelo entre as veias e artérias, que ele chamou de capilares. Sua descoberta estabeleceu como o oxigênio respirado entra na corrente sanguínea e serve ao corpo.

No século 19, a histologia era uma disciplina acadêmica por direito próprio. O anatomista francês Xavier Bichat introduziu o conceito de tecido na anatomia em 1801, e o termo "histologia" ( alemão : Histologie ), cunhado para denotar o "estudo dos tecidos", apareceu pela primeira vez em um livro de Karl Meyer em 1819. Bichat descreveu vinte e um tecidos humanos, que podem ser incluídos nas quatro categorias atualmente aceitas pelos histologistas. O uso de ilustrações em histologia, considerado inútil por Bichat, foi promovido por Jean Cruveilhier .

No início da década de 1830, Purkynĕ inventou um micrótomo com alta precisão.

Durante o século 19, muitas técnicas de fixação foram desenvolvidas por Adolph Hannover (soluções de cromatos e ácido crômico ), Franz Schulze e Max Schultze ( ácido ósmico ), Alexander Butlerov ( formaldeído ) e Benedikt Stilling ( congelamento ).

As técnicas de montagem foram desenvolvidas por Rudolf Heidenhain (1824-1898), que introduziu a goma arábica ; Salomon Stricker (1834-1898), que defendeu uma mistura de cera e óleo; e Andrew Pritchard (1804-1884) que, em 1832, usava uma mistura de goma / cola de peixe . No mesmo ano, o bálsamo do Canadá apareceu em cena e, em 1869, Edwin Klebs (1834-1913) relatou que havia alguns anos embebido seus espécimes em parafina.

O Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1906 foi concedido aos histologistas Camillo Golgi e Santiago Ramon y Cajal . Eles tinham interpretações conflitantes da estrutura neural do cérebro com base em interpretações diferentes das mesmas imagens. Ramón y Cajal ganhou o prêmio por sua teoria correta, e Golgi pela técnica de coloração de prata que ele inventou para torná-la possível.

Direções futuras

Histologia in vivo

Atualmente, há um grande interesse no desenvolvimento de técnicas para histologia in vivo (predominantemente por meio de ressonância magnética ), que permitiriam aos médicos coletar de forma não invasiva informações sobre tecidos saudáveis ​​e doentes em pacientes vivos, ao invés de amostras fixas de tecidos.

Notas

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