Ensaio enzimático - Enzyme assay

Espectrofotômetro Beckman DU640 UV / Vis

Os ensaios enzimáticos são métodos laboratoriais para medir a atividade enzimática . Eles são vitais para o estudo da cinética enzimática e da inibição enzimática .

Unidades de enzima

A quantidade ou concentração de uma enzima pode ser expressa em quantidades molares , como com qualquer outro produto químico, ou em termos de atividade em unidades de enzima .

Atividade enzimática

Atividade enzimática = moles de substrato convertido por unidade de tempo = taxa x volume de reação. A atividade enzimática é uma medida da quantidade de enzima ativa presente e, portanto, depende das condições que devem ser especificadas . A unidade SI é o katal , 1 katal = 1 mol s −1 , mas esta é uma unidade excessivamente grande. Um valor mais prático e comumente usado é a unidade de enzima (U) = 1 μmol min −1 . 1 U corresponde a 16,67 nanocatais .

A atividade da enzima, conforme fornecida em katal, geralmente se refere àquela do substrato alvo natural assumido da enzima. A atividade enzimática também pode ser dada como a de certos substratos padronizados, como a gelatina , então medida em unidades de digestão de gelatina (GDU), ou proteínas do leite, e então medida em unidades de coagulação do leite (MCU). As unidades GDU e MCU são baseadas na rapidez com que um grama da enzima digere a gelatina ou as proteínas do leite, respectivamente. 1 GDU equivale a aproximadamente 1,5 MCU.

Uma quantidade maior de substrato aumentará a taxa de reação com as enzimas; entretanto, depois de um certo ponto, a taxa de reação se estabilizará porque a quantidade de sítios ativos disponíveis permaneceu constante.

Atividade específica

A atividade específica de uma enzima é outra unidade comum. Esta é a atividade de uma enzima por miligrama de proteína total (expressa em μmol min −1 mg −1 ). A atividade específica fornece uma medida da pureza da enzima na mistura. É o micro moles de produto formado por uma enzima em um determinado período de tempo (minutos) sob determinadas condições por miligrama de proteínas totais. A atividade específica é igual à taxa de reação multiplicada pelo volume da reação dividido pela massa da proteína total. A unidade SI é katal / kg, mas uma unidade mais prática é μmol / mgmin.

A atividade específica é uma medida da processabilidade da enzima (a capacidade da enzima de ser processada), em uma concentração de substrato específica (geralmente saturante) e geralmente é constante para uma enzima pura.

Um processo de titulação do local ativo pode ser feito para a eliminação de erros decorrentes de diferenças nos lotes de cultivo e / ou enzima mal dobrada e problemas semelhantes. Esta é uma medida da quantidade de enzima ativa, calculada, por exemplo, titulando a quantidade de sítios ativos presentes, empregando um inibidor irreversível. A atividade específica deve então ser expressa como μmol min −1 mg −1 de enzima ativa. Se o peso molecular da enzima for conhecido, o número de turnover , ou produto μmol por segundo por μmol de enzima ativa, pode ser calculado a partir da atividade específica. O número de turnover pode ser visualizado como o número de vezes que cada molécula de enzima realiza seu ciclo catalítico por segundo.

Terminologia relacionada

A taxa de uma reação é a concentração de substrato desaparecendo (ou produto produzido) por unidade de tempo (mol L −1 s −1 ).

A % de pureza é 100% × (atividade específica da amostra de enzima / atividade específica da enzima pura). A amostra impura tem menor atividade específica porque parte da massa não é realmente enzima. Se a atividade específica da enzima 100% pura for conhecida, então uma amostra impura terá uma atividade específica mais baixa, permitindo que a pureza seja calculada e, então, obtendo um resultado claro.

Tipos de ensaio

Todos os ensaios enzimáticos medem o consumo de substrato ou a produção de produto ao longo do tempo. Existe um grande número de métodos diferentes de medição das concentrações de substratos e produtos e muitas enzimas podem ser testadas de várias maneiras diferentes. Os bioquímicos geralmente estudam reações catalisadas por enzimas usando quatro tipos de experimentos:

  • Experimentos de taxa inicial . Quando uma enzima é misturada com um grande excesso do substrato, o intermediário enzima-substrato se acumula em um transiente inicial rápido. Em seguida, a reação atinge uma cinética de estado estacionário em que os intermediários do substrato da enzima permanecem aproximadamente constantes ao longo do tempo e a taxa de reação muda de forma relativamente lenta. As taxas são medidas por um curto período após a obtenção do estado quase estacionário, normalmente monitorando o acúmulo de produto com o tempo. Como as medições são realizadas por um período muito curto e devido ao grande excesso de substrato, pode-se estimar que a quantidade de substrato livre é aproximadamente igual à quantidade do substrato inicial. O experimento de taxa inicial é o mais simples de realizar e analisar, sendo relativamente livre de complicações, como reação reversa e degradação enzimática. É, portanto, de longe, o tipo de experimento mais comumente usado em cinética enzimática.
  • Experimentos de curva de progresso . Nestes experimentos, os parâmetros cinéticos são determinados a partir de expressões para as concentrações das espécies em função do tempo. A concentração do substrato ou produto é registrada no tempo após o transiente rápido inicial e por um período suficientemente longo para permitir que a reação se aproxime do equilíbrio. Os experimentos de curva de progresso foram amplamente usados ​​no período inicial da cinética enzimática, mas agora são menos comuns.
  • Experimentos de cinética transitória . Nesses experimentos, o comportamento da reação é rastreado durante o transiente rápido inicial, à medida que o intermediário atinge o período de cinética de estado estacionário. Esses experimentos são mais difíceis de realizar do que qualquer uma das duas classes acima porque eles requerem técnicas especializadas (como fotólise instantânea de compostos enjaulados) ou mistura rápida (como fluxo interrompido, fluxo extinto ou fluxo contínuo).
  • Experimentos de relaxamento . Nessas experiências, uma mistura de equilíbrio de enzima, substrato e produto é perturbada, por exemplo, por um salto de temperatura , pressão ou pH, e o retorno ao equilíbrio é monitorado. A análise desses experimentos requer consideração da reação totalmente reversível. Além disso, os experimentos de relaxamento são relativamente insensíveis aos detalhes mecanísticos e, portanto, não são normalmente usados ​​para a identificação do mecanismo, embora possam estar em condições apropriadas.

Os ensaios enzimáticos podem ser divididos em dois grupos de acordo com seu método de amostragem: ensaios contínuos , onde o ensaio dá uma leitura contínua da atividade, e ensaios descontínuos , onde as amostras são coletadas, a reação interrompida e, em seguida, a concentração de substratos / produtos determinada.

Porta- cubetas com temperatura controlada em um espectrofotômetro.

Ensaios contínuos

Os ensaios contínuos são mais convenientes, com um ensaio fornecendo a taxa de reação sem a necessidade de trabalho adicional. Existem muitos tipos diferentes de ensaios contínuos.

Espectrofotométrico

Em ensaios espectrofotométricos , você segue o curso da reação medindo uma alteração na quantidade de luz que a solução de ensaio absorve. Se esta luz estiver na região visível, você pode realmente ver uma mudança na cor do ensaio, e estes são chamados de ensaios colorimétricos . O ensaio MTT , um ensaio redox usando um corante de tetrazólio como substrato, é um exemplo de ensaio colorimétrico.

A luz ultravioleta é freqüentemente usada, uma vez que as coenzimas comuns NADH e NADPH absorvem a luz ultravioleta em suas formas reduzidas , mas não em suas formas oxidadas . Uma oxidorredutase usando NADH como substrato poderia, portanto, ser testada seguindo a diminuição da absorvância de UV em um comprimento de onda de 340 nm, à medida que consome a coenzima.

Ensaios diretos versus acoplados

Ensaio acoplado para hexoquinase usando glicose-6-fosfato desidrogenase .

Mesmo quando a reação enzimática não resulta em uma mudança na absorbância da luz, ainda pode ser possível usar um ensaio espectrofotométrico para a enzima usando um ensaio acoplado . Aqui, o produto de uma reação é usado como substrato de outra reação facilmente detectável. Por exemplo, a figura 1 mostra o ensaio acoplado para a enzima hexoquinase , que pode ser testado acoplando sua produção de glicose-6-fosfato à produção de NADPH, usando glicose-6-fosfato desidrogenase .

Fluorométrico

Fluorescência é quando uma molécula emite luz de um comprimento de onda após absorver luz de um comprimento de onda diferente. Os ensaios fluorométricos usam uma diferença na fluorescência do substrato do produto para medir a reação enzimática. Esses ensaios são em geral muito mais sensíveis do que os ensaios espectrofotométricos, mas podem sofrer interferência causada por impurezas e pela instabilidade de muitos compostos fluorescentes quando expostos à luz.

Um exemplo desses ensaios é novamente o uso das coenzimas nucleotídicas NADH e NADPH. Aqui, as formas reduzidas são fluorescentes e as formas oxidadas não fluorescentes. As reações de oxidação podem, portanto, ser seguidas por uma diminuição na fluorescência e as reações de redução por um aumento. Substratos sintéticos que liberam um corante fluorescente em uma reação catalisada por enzima também estão disponíveis, como 4-metilumbeliferil-β-D-galactosídeo para ensaio de β-galactosidase ou 4-metilumbeliferil-butirato para ensaio de Candida rugosa lipase .

Calorimétrico

Quimioluminescência do luminol

Calorimetria é a medição do calor liberado ou absorvido por reações químicas. Esses ensaios são muito gerais, uma vez que muitas reações envolvem alguma mudança no calor e com o uso de um microcalorímetro, não é necessária muita enzima ou substrato. Esses ensaios podem ser usados ​​para medir reações impossíveis de serem analisadas de outra forma.

Quimioluminescente

A quimiluminescência é a emissão de luz por uma reação química. Algumas reações enzimáticas produzem luz e isso pode ser medido para detectar a formação do produto. Esses tipos de ensaio podem ser extremamente sensíveis, já que a luz produzida pode ser capturada por filme fotográfico ao longo de dias ou semanas, mas pode ser difícil de quantificar, porque nem toda a luz liberada por uma reação será detectada.

A detecção de peroxidase de rábano por quimioluminescência enzimática (ECL) é um método comum de detecção de anticorpos em western blotting . Outro exemplo é a enzima luciferase , esta é encontrada em vaga-lumes e naturalmente produz luz a partir de seu substrato luciferina.

Dispersão de luz

A dispersão de luz estática mede o produto da massa molar média em peso e a concentração de macromoléculas em solução. Dada uma concentração total fixa de uma ou mais espécies ao longo do tempo de medição, o sinal de espalhamento é uma medida direta da massa molar média em peso da solução, que irá variar conforme os complexos se formam ou se dissociam. Portanto, a medição quantifica a estequiometria dos complexos, bem como a cinética. Os ensaios de dispersão de luz da cinética de proteínas são uma técnica muito geral que não requer uma enzima.

Termoforese em microescala

A termoforese em microescala (MST) mede o tamanho, a carga e a entropia de hidratação de moléculas / substratos em equilíbrio. O movimento termoforético de um substrato marcado com fluorescência muda significativamente à medida que é modificado por uma enzima. Esta atividade enzimática pode ser medida com alta resolução em tempo real. O consumo de material do método MST totalmente óptico é muito baixo, apenas 5 μl de volume de amostra e 10 nM de concentração de enzima são necessários para medir as constantes de taxa enzimática para atividade e inibição. O MST permite que os analistas meçam a modificação de dois substratos diferentes ao mesmo tempo ( multiplexação ) se ambos os substratos forem marcados com fluoróforos diferentes. Assim, experimentos de competição de substrato podem ser realizados.

Ensaios descontínuos

Os ensaios descontínuos são quando as amostras são retiradas de uma reação enzimática em intervalos e a quantidade de produção do produto ou consumo de substrato é medida nessas amostras.

Radiométrico

Os ensaios radiométricos medem a incorporação de radioatividade em substratos ou sua liberação de substratos. Os isótopos radioativos usados ​​com mais frequência nesses ensaios são 14 C, 32 P, 35 S e 125 I. Uma vez que os isótopos radioativos podem permitir a marcação específica de um único átomo de um substrato, esses ensaios são extremamente sensíveis e específicos. Eles são freqüentemente usados ​​em bioquímica e muitas vezes são a única maneira de medir uma reação específica em extratos brutos (as misturas complexas de enzimas produzidas quando você lisa células).

A radioatividade é geralmente medida nesses procedimentos usando um contador de cintilação .

Cromatográfico

Os ensaios cromatográficos medem a formação do produto, separando a mistura de reação em seus componentes por cromatografia . Isso geralmente é feito por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), mas também pode usar a técnica mais simples de cromatografia em camada fina . Embora essa abordagem possa precisar de muito material, sua sensibilidade pode ser aumentada marcando os substratos / produtos com uma etiqueta radioativa ou fluorescente. A sensibilidade do ensaio também foi aumentada com a troca de protocolos para instrumentos cromatográficos aprimorados (por exemplo, cromatografia líquida de ultra-alta pressão) que operam na pressão da bomba algumas vezes mais alta do que os instrumentos de HPLC (consulte Cromatografia líquida de alto desempenho # Pressão da bomba ).

Fatores para controlar em ensaios

Uma câmara de pressão para medir a atividade enzimática em alta pressão.

Vários fatores afetam o resultado do ensaio e uma revisão recente resume os vários parâmetros que precisam ser monitorados para manter um ensaio instalado e funcionando.

  • Concentração de sal : a maioria das enzimas não tolera concentrações extremamente altas de sal. Os íons interferem nas fracas ligações iônicas das proteínas . Enzimas típicas são ativas em concentrações de sal de 1-500 mM. Como de costume, há exceções, como algas e bactérias halofílicas .
  • Efeitos da temperatura : Todas as enzimas funcionam dentro de uma faixa de temperatura específica para o organismo. Os aumentos de temperatura geralmente levam a aumentos nas taxas de reação. Há um limite para o aumento porque temperaturas mais altas levam a uma diminuição acentuada nas taxas de reação. Isso se deve à desnaturação (alteração) da estrutura da proteína resultante da quebra das ligações iônicas e de hidrogênio fracas que estabilizam a estrutura tridimensional do sítio ativo da enzima. A temperatura "ótima" para as enzimas humanas é geralmente entre 35 e 40 ° C. A temperatura média para humanos é de 37 ° C. As enzimas humanas começam a desnaturar rapidamente em temperaturas acima de 40 ° C. As enzimas de arquéias termofílicas encontradas nas fontes termais são estáveis ​​até 100 ° C. No entanto, a ideia de uma taxa "ótima" de uma reação enzimática é enganosa, pois a taxa observada em qualquer temperatura é o produto de duas taxas, a taxa de reação e a taxa de desnaturação. Se você fosse usar um ensaio para medir a atividade por um segundo, ele daria alta atividade em altas temperaturas; no entanto, se você fosse usar um ensaio para medir a formação do produto durante uma hora, ele lhe daria baixa atividade nessas temperaturas.
  • Efeitos do pH : A maioria das enzimas é sensível ao pH e tem faixas específicas de atividade. Todos têm um pH ótimo. O pH pode interromper a atividade da enzima desnaturando (alterando) a forma tridimensional da enzima, quebrando as ligações iônicas e de hidrogênio . A maioria das enzimas funciona entre um pH de 6 e 8; entretanto, a pepsina no estômago funciona melhor com pH 2 e a tripsina com pH 8.
  • Saturação do substrato : O aumento da concentração do substrato aumenta a taxa de reação (atividade enzimática). No entanto, a saturação da enzima limita as taxas de reação. Uma enzima está saturada quando os sítios ativos de todas as moléculas estão ocupados na maior parte do tempo. No ponto de saturação, a reação não irá acelerar, não importa quanto substrato adicional seja adicionado. O gráfico da taxa de reação se estabilizará.
  • O nível de aglomeração , grandes quantidades de macromoléculas em uma solução irão alterar as taxas e constantes de equilíbrio das reações enzimáticas, por meio de um efeito chamado aglomeração macromolecular .

Lista de ensaios enzimáticos

Veja também

Referências

  1. ^ Comitê de nomenclatura da união internacional da bioquímica (NC-IUB) (1979). "Unidades de atividade enzimática". EUR. J. Biochem . 97 (2): 319–20. doi : 10.1111 / j.1432-1033.1979.tb13116.x .
  2. ^ Quantos? Um Dicionário de Unidades de Medida, de Russ Rowlett, da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill
  3. ^ a b Srinivasan, Bharath (2020-09-27). "Palavras de conselho: ensinando cinética enzimática" . The FEBS Journal . 288 (7): 2068–2083. doi : 10.1111 / febs.15537 . ISSN  1742-464X . PMID  32981225 .
  4. ^ Schnell, S .; Chappell, MJ; Evans, ND; Roussel, MR (2006). "O problema de distinção do mecanismo na cinética bioquímica: A reação de enzima única e substrato único como um estudo de caso". Comptes Rendus Biologies . 329 (1): 51–61. doi : 10.1016 / j.crvi.2005.09.005 . PMID  16399643 .
  5. ^ Srinivasan, Bharath (2021). "Tratamento explícito de Non-Michaelis-Menten e cinética atípica na descoberta precoce de drogas *". ChemMedChem . 16 (6): 899–918. doi : 10.1002 / cmdc.202000791 . PMID  33231926 . S2CID  227157473 .
  6. ^ Srinivasan, Bharath (2020-09-27). "Palavras de conselho: ensinando cinética enzimática" . The FEBS Journal . 288 (7): 2068–2083. doi : 10.1111 / febs.15537 . ISSN  1742-464X . PMID  32981225 .
  7. ^ Bergmeyer, HU (1974). Métodos de análise enzimática . 4 . Nova York: Academic Press. pp. 2066–72. ISBN 0-89573-236-X.
  8. ^ Passonneau, JV; Lowry, OH (1993). Análise enzimática. Um guia prático . Totowa NJ: Humana Press. pp. 85-110.
  9. ^ Menden, Ariane (26 de julho de 2019). "Um ensaio in-vitro miniaturizado rápido desenvolvido para quantificação da atividade da enzima lipase" . Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry . 34 (1): 1474–1480. doi : 10.1080 / 14756366.2019.1651312 . PMC  6713963 . PMID  31414611 .
  10. ^ Todd MJ, Gomez J (setembro de 2001). "Cinética enzimática determinada usando calorimetria: um ensaio geral para a atividade enzimática?". Anal. Biochem . 296 (2): 179–87. doi : 10.1006 / abio.2001.5218 . PMID  11554713 . S2CID  18567619 .
  11. ^ Wienken CJ; et al. (2010). "Ensaios de ligação de proteínas em líquidos biológicos usando termoforese em microescala" . Nature Communications . 1 (7): 100. bibcode : 2010NatCo ... 1..100W . doi : 10.1038 / ncomms1093 . PMID  20981028 .
  12. ^ Duhr S, Braun D (dezembro de 2006). "Por que as moléculas se movem ao longo de um gradiente de temperatura" . Proc. Natl. Acad. Sci. EUA . 103 (52): 19678–82. Bibcode : 2006PNAS..10319678D . doi : 10.1073 / pnas.0603873103 . PMC  1750914 . PMID  17164337 .
  13. ^ Baaske P, Wienken C, Duhr S (2009). "Optisch erzeugte Thermophorese für die Bioanalytik" [Termoforese gerada opticamente para bioanálise] (PDF) . Biophotonik (em alemão): 22–24.
  14. ^ Churchwell, M; Twaddle, N; Meeker, L; Doerge, D. (outubro de 2005). "Melhorando a sensibilidade em cromatografia líquida-espectrometria de massa" . Journal of Chromatography B . 825 (2): 134–143. doi : 10.1016 / j.jchromb.2005.05.037 . PMID  16002352 .
  15. ^ Srinivasan B, Kantae V, Robinson J, e outros. (Abril de 2020). "Ressuscitando a fênix: Quando um ensaio falha". Revisões de pesquisas medicinais . 40 (5): 1776–1793. doi : 10.1002 / med.21670 . hdl : 10289/3552 . PMID  32285494 . S2CID  215758654 .
  16. ^ Daniel RM, Peterson ME, Danson MJ, e outros. (Janeiro de 2010). "A base molecular do efeito da temperatura na atividade enzimática". Biochem. J . 425 (2): 353–60. doi : 10.1042 / BJ20091254 . hdl : 10289/3552 . PMID  19849667 .
  17. ^ Cowan DA (1997). "Proteínas termofílicas: estabilidade e função em solventes aquosos e orgânicos". Comp. Biochem. Physiol. A Physiol . 118 (3): 429–38. doi : 10.1016 / S0300-9629 (97) 00004-2 . PMID  9406427 .
  18. ^ Minton AP (2001). "A influência do apinhamento macromolecular e do confinamento macromolecular nas reações bioquímicas em meios fisiológicos" . J. Biol. Chem . 276 (14): 10577–80. doi : 10.1074 / jbc.R100005200 . PMID  11279227 .

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