Dicroísmo circular - Circular dichroism

Dicroísmo circular ( CD ) é o dicroísmo envolvendo luz polarizada circularmente , ou seja, a absorção diferencial de luz para destros e canhotos . A luz polarizada circular à esquerda (LHC) e circular à direita (RHC) representa dois possíveis estados de momento angular de spin para um fóton e, portanto, dicroísmo circular também é conhecido como dicroísmo para momento angular de spin. Esse fenômeno foi descoberto por Jean-Baptiste Biot , Augustin Fresnel e Aimé Cotton na primeira metade do século XIX. O dicroísmo circular e a birrefringência circular são manifestações da atividade óptica . É exibido nas bandas de absorção de moléculas quirais opticamente ativas . A espectroscopia de CD tem uma ampla gama de aplicações em muitos campos diferentes. Mais notavelmente, o UV CD é usado para investigar a estrutura secundária das proteínas. UV / Vis CD é usado para investigar transições de transferência de carga . O CD no infravermelho próximo é usado para investigar a estrutura geométrica e eletrônica por meio da sondagem das transições dd de metal . O dicroísmo circular vibracional , que usa luz da região de energia infravermelha , é usado para estudos estruturais de pequenas moléculas orgânicas e, mais recentemente, proteínas e DNA.

Princípios físicos

Polarização circular da luz

A radiação eletromagnética consiste em um campo elétrico e magnético que oscila perpendicularmente um ao outro e na direção de propagação, uma onda transversal . Enquanto a luz polarizada linearmente ocorre quando o vetor do campo elétrico oscila apenas em um plano, a luz polarizada circularmente ocorre quando a direção do vetor do campo elétrico gira em torno de sua direção de propagação enquanto o vetor retém magnitude constante. Em um único ponto no espaço, o vetor polarizado circularmente traçará um círculo ao longo de um período da frequência da onda, daí o nome. Os dois diagramas abaixo mostram os vetores do campo elétrico da luz polarizada linear e circularmente, em um momento do tempo, para uma gama de posições; o gráfico do vetor elétrico polarizado circularmente forma uma hélice ao longo da direção de propagação . Para luz polarizada circularmente à esquerda (LCP) com propagação em direção ao observador, o vetor elétrico gira no sentido anti-horário . Para luz polarizada circularmente direita (RCP), o vetor elétrico gira no sentido horário.

Linearly pol.png Circularmente pol.png

Interação da luz polarizada circularmente com a matéria

Quando a luz polarizada circularmente passa por um meio absorvente opticamente ativo, as velocidades entre as polarizações direita e esquerda diferem ( ), bem como seu comprimento de onda ( ) e a extensão em que são absorvidas ( ). O dicroísmo circular é a diferença . O campo elétrico de um feixe de luz causa um deslocamento linear de carga ao interagir com uma molécula ( dipolo elétrico ), enquanto seu campo magnético provoca uma circulação de carga ( dipolo magnético ). Esses dois movimentos combinados causam uma excitação de um elétron em um movimento helicoidal, que inclui translação e rotação e seus operadores associados . A relação determinada experimentalmente entre a força rotacional de uma amostra e a é dada por

A força rotacional também foi determinada teoricamente,

Vemos a partir dessas duas equações que, para serem diferentes de zero , os operadores de momento dipolar elétrico e magnético ( e ) devem se transformar na mesma representação irredutível . e são os únicos grupos de pontos onde isso pode ocorrer, tornando apenas as moléculas quirais CD ativas.

Simplificando, como a própria luz polarizada circularmente é "quiral", ela interage de maneira diferente com as moléculas quirais . Ou seja, os dois tipos de luz polarizada circularmente são absorvidos em extensões diferentes. Em um experimento de CD, quantidades iguais de luz polarizada circularmente à esquerda e à direita de um comprimento de onda selecionado são irradiadas alternadamente em uma amostra (quiral). Uma das duas polarizações é absorvida mais do que a outra, e essa diferença de absorção dependente do comprimento de onda é medida, produzindo o espectro CD da amostra. Devido à interação com a molécula, o vetor do campo elétrico da luz traça um caminho elíptico após passar pela amostra.

É importante que a quiralidade da molécula possa ser conformacional em vez de estrutural. Ou seja, por exemplo, uma molécula de proteína com estrutura secundária helicoidal pode ter um CD que muda com as mudanças na conformação.

Absorbância delta

Por definição,

onde (Absorbância Delta) é a diferença entre a absorbância da luz polarizada circularmente à esquerda (LCP) e da luz polarizada circularmente à direita (RCP) (isso é o que geralmente é medido). é uma função do comprimento de onda , portanto, para uma medição ser significativa, o comprimento de onda no qual ela foi realizada deve ser conhecido.

Dicroísmo circular molar

Também pode ser expresso, pela aplicação da lei de Beer , como:

Onde

e são os coeficientes de extinção molar para luz LCP e RCP,
é a concentração molar ,
é o comprimento do caminho em centímetros (cm).

Então

é o dicroísmo circular molar. Essa propriedade intrínseca é o que geralmente se entende por dicroísmo circular da substância. Como é uma função do comprimento de onda, um valor de dicroísmo circular molar ( ) deve especificar o comprimento de onda no qual é válido.

Efeitos extrínsecos no dicroísmo circular

Em muitas aplicações práticas de dicroísmo circular (CD), como discutido abaixo, o CD medido não é simplesmente uma propriedade intrínseca da molécula, mas depende da conformação molecular. Nesse caso, o CD também pode ser uma função da temperatura, concentração e ambiente químico, incluindo solventes. Nesse caso, o valor de CD relatado também deve especificar esses outros fatores relevantes para ser significativo.

Em estruturas ordenadas sem simetria rotacional dupla, atividade óptica, incluindo transmissão diferencial (e reflexão) de ondas polarizadas circularmente também depende da direção de propagação através do material. Nesse caso, a chamada quiralidade extrínseca 3d está associada à orientação mútua do feixe de luz e da estrutura.

Elipticidade molar

Embora geralmente seja medido, por razões históricas, a maioria das medições são relatadas em graus de elipticidade. A elipticidade molar é o dicroísmo circular corrigido pela concentração. O dicroísmo circular molar e a elipticidade molar são prontamente interconvertidos pela equação:

A luz elíptica polarizada (violeta) é composta de contribuições desiguais de luz polarizada circular direita (azul) e esquerda (vermelha).

Esta relação é derivada pela definição da elipticidade da polarização como:

Onde

e são as magnitudes dos vetores do campo elétrico da luz polarizada circularmente à direita e circularmente à esquerda, respectivamente.

Quando igual (quando não há diferença na absorbância da luz polarizada circular direita e esquerda), é 0 ° e a luz é polarizada linearmente . Quando ou é igual a zero (quando há absorbância completa da luz circular polarizada em uma direção), é 45 ° e a luz é circularmente polarizada .

Geralmente, o efeito de dicroísmo circular é pequeno, então é pequeno e pode ser aproximado como em radianos . Desde a intensidade ou irradiação , , da luz é proporcional ao quadrado do vetor de campo elétrico, a elipticidade torna-se:

Então, substituindo I usando a lei de Beer na forma de logaritmo natural :

A elipticidade agora pode ser escrita como:

Uma vez que , esta expressão pode ser aproximada expandindo os exponenciais em uma série de Taylor para a primeira ordem e, em seguida, descartando os termos de em comparação com a unidade e convertendo de radianos para graus:

A dependência linear da concentração de soluto e do comprimento do caminho é removida pela definição da elipticidade molar como,

Em seguida, combinando as duas últimas expressões com a lei de Beer , a elipticidade molar torna-se:

As unidades de elipticidade molar são historicamente (deg · cm 2 / dmol). Para calcular a elipticidade molar, a concentração da amostra (g / L), o comprimento do caminho da célula (cm) e o peso molecular (g / mol) devem ser conhecidos.

Se a amostra for uma proteína, o peso médio do resíduo (peso molecular médio dos resíduos de aminoácidos que ela contém) é frequentemente usado no lugar do peso molecular, tratando essencialmente a proteína como uma solução de aminoácidos. O uso da elipticidade média do resíduo facilita a comparação do CD de proteínas de peso molecular diferente; o uso deste CD normalizado é importante em estudos da estrutura da proteína.

Elipticidade de resíduo médio

Métodos para estimar a estrutura secundária em polímeros, proteínas e polipeptídeos em particular, muitas vezes requerem que o espectro de elipticidade molar medido seja convertido em um valor normalizado, especificamente um valor independente do comprimento do polímero. A elipticidade média do resíduo é usada para este propósito; é simplesmente a elipticidade molar medida da molécula dividida pelo número de unidades monoméricas (resíduos) na molécula.

Aplicação a moléculas biológicas

Painel superior: espectroscopia de dicroísmo circular na região do comprimento de onda ultravioleta (UV-CD) da proteína de fusão MBP-citocromo b 6 em diferentes soluções detergentes. Mostra que a proteína em DM, assim como em solução de Triton X-100, recuperou sua estrutura. No entanto, os espectros obtidos a partir da solução SDS mostram diminuição da elipticidade na faixa entre 200 e 210 nm, o que indica recuperação incompleta da estrutura secundária.
Painel inferior: O conteúdo das estruturas secundárias previstas a partir dos espectros do CD usando o algoritmo CDSSTR. A proteína na solução SDS mostra maior conteúdo de estruturas desordenadas e menor conteúdo de hélices.

Em geral, este fenômeno será exibido em bandas de absorção de qualquer molécula opticamente ativa . Como consequência, o dicroísmo circular é exibido por moléculas biológicas, por causa de seus componentes dextrógiro e levógiro . Ainda mais importante é que uma estrutura secundária também dará um CD distinto às suas respectivas moléculas. Portanto, a hélice alfa das proteínas e a dupla hélice dos ácidos nucléicos possuem assinaturas espectrais de CD representativas de suas estruturas. A capacidade do CD de fornecer uma assinatura estrutural representativa o torna uma ferramenta poderosa na bioquímica moderna, com aplicações que podem ser encontradas em praticamente todos os campos de estudo.

A CD está intimamente relacionada à técnica de dispersão óptica rotatória (ORD) e é geralmente considerada mais avançada. O CD é medido nas bandas de absorção da molécula de interesse ou próximo a elas, enquanto o ORD pode ser medido longe dessas bandas. A vantagem do CD é aparente na análise dos dados. Os elementos estruturais são mais claramente distinguidos, uma vez que suas bandas gravadas não se sobrepõem extensivamente em determinados comprimentos de onda, como acontece no ORD. Em princípio, essas duas medidas espectrais podem ser interconvertidas por meio de uma transformada integral (relação Kramers-Kronig ), se todas as absorções estiverem incluídas nas medidas.

O espectro CD ultravioleta ( ultravioleta ) das proteínas pode revelar características importantes de sua estrutura secundária . Os espectros de CD podem ser prontamente usados ​​para estimar a fração de uma molécula que está na conformação de hélice alfa , a conformação de folha beta , a conformação de volta beta ou alguma outra conformação (por exemplo, bobina aleatória ). Essas atribuições fracionárias colocam restrições importantes nas possíveis conformações secundárias em que a proteína pode estar. CD não pode, em geral, dizer onde as hélices alfa detectadas estão localizadas dentro da molécula ou mesmo prever quantas existem. Apesar disso, o CD é uma ferramenta valiosa, especialmente para mostrar mudanças na conformação. Pode, por exemplo, ser usado para estudar como a estrutura secundária de uma molécula muda em função da temperatura ou da concentração de agentes desnaturantes, por exemplo, cloreto de guanidínio ou ureia . Desta forma, pode revelar informações termodinâmicas importantes sobre a molécula (como a entalpia e a energia livre de desnaturação de Gibbs ) que não podem ser facilmente obtidas. Qualquer pessoa que tente estudar uma proteína encontrará a CD uma ferramenta valiosa para verificar se a proteína está em sua conformação nativa antes de realizar experimentos extensos e / ou caros com ela. Além disso, há uma série de outros usos para a espectroscopia de CD na química de proteínas não relacionados à estimativa da fração de hélice alfa. Além disso, a espectroscopia de CD tem sido usada em estudos de interface bioinorgânica. Especificamente, foi usado para analisar as diferenças na estrutura secundária de uma proteína projetada antes e depois da titulação com um reagente.

O espectro de CD de UV próximo (> 250 nm) de proteínas fornece informações sobre a estrutura terciária . Os sinais obtidos na região de 250-300 nm são devidos à absorção, orientação dipolar e à natureza do ambiente circundante da fenilalanina, tirosina, cisteína (ou pontes dissulfeto SS ) e aminoácidos de triptofano . Ao contrário do CD de UV distante, o espectro do CD de UV próximo não pode ser atribuído a nenhuma estrutura 3D específica. Em vez disso, os espectros de CD perto de UV fornecem informações estruturais sobre a natureza dos grupos protéticos nas proteínas, por exemplo, os grupos heme na hemoglobina e no citocromo c .

A espectroscopia de CD visível é uma técnica muito poderosa para estudar as interações metal-proteína e pode resolver transições eletrônicas d-d individuais como bandas separadas. Os espectros de CD na região da luz visível são produzidos apenas quando um íon metálico está em um ambiente quiral, portanto, os íons metálicos livres em solução não são detectados. Isso tem a vantagem de observar apenas o metal ligado à proteína, de modo que a dependência do pH e a estequiometrias são facilmente obtidas. A atividade óptica em complexos de íons de metal de transição tem sido atribuída a efeitos configuracionais, conformacionais e vicinais. Klewpatinond e Viles (2007) produziram um conjunto de regras empíricas para prever o aparecimento de espectros de CD visíveis para complexos quadrados-planos de Cu 2+ e Ni 2+ envolvendo histidina e coordenação de cadeia principal.

O CD fornece informações estruturais menos específicas do que a cristalografia de raios-X e a espectroscopia de NMR de proteína , por exemplo, que fornecem dados de resolução atômica. No entanto, a espectroscopia de CD é um método rápido que não requer grandes quantidades de proteínas ou processamento extensivo de dados. Assim, o CD pode ser usado para pesquisar um grande número de condições de solvente , variando a temperatura , pH , salinidade e a presença de vários cofatores.

A espectroscopia de CD é geralmente usada para estudar proteínas em solução e, portanto, complementa os métodos que estudam o estado sólido. Isso também é uma limitação, pois muitas proteínas são incorporadas às membranas em seu estado nativo e as soluções que contêm estruturas de membrana costumam se espalhar fortemente. O CD às vezes é medido em filmes finos.

A espectroscopia de CD também tem sido feita usando materiais semicondutores como TiO 2 para obter grandes sinais na faixa de UV de comprimentos de onda, onde as transições eletrônicas para biomoléculas ocorrem frequentemente.

Limitações experimentais

CD também foi estudado em carboidratos , mas com sucesso limitado devido às dificuldades experimentais associadas à medição de espectros de CD na região ultravioleta de vácuo (VUV) do espectro (100-200 nm), onde as bandas CD correspondentes de carboidratos não substituídos estão . Os carboidratos substituídos com bandas acima da região VUV foram medidos com sucesso.

A medição de CD também é complicada pelo fato de que os sistemas tampão aquosos típicos freqüentemente absorvem na faixa onde as características estruturais exibem absorção diferencial de luz polarizada circularmente. Os tampões de fosfato , sulfato , carbonato e acetato são geralmente incompatíveis com CD, a menos que sejam extremamente diluídos, por exemplo, na faixa de 10–50 mM. O sistema de buffer TRIS deve ser completamente evitado ao executar far-UV CD. Compostos de borato e ônio são freqüentemente usados ​​para estabelecer a faixa de pH apropriada para experimentos de CD. Alguns experimentadores substituíram o íon cloreto pelo fluoreto porque o fluoreto é menos absorvido no ultravioleta distante, e alguns trabalharam em água pura. Outra técnica, quase universal, é minimizar a absorção de solvente usando células de comprimento de caminho mais curto ao trabalhar no UV distante, comprimentos de caminho de 0,1 mm não são incomuns neste trabalho.

Além de medir em sistemas aquosos, CD, particularmente far-UV CD, pode ser medido em solventes orgânicos, por exemplo, etanol, metanol, trifluoroetanol (TFE). Este último tem a vantagem de induzir a formação de estruturas de proteínas, induzindo folhas beta em algumas e hélices alfa em outras, que não apareceriam em condições aquosas normais. Os solventes orgânicos mais comuns, como acetonitrila , THF , clorofórmio , diclorometano , são, no entanto, incompatíveis com o CD ultravioleta.

Pode ser interessante notar que os espectros de CD de proteína usados ​​na estimativa da estrutura secundária estão relacionados às absorções orbitais π a π * das ligações amida que ligam os aminoácidos. Essas bandas de absorção encontram-se parcialmente no chamado ultravioleta de vácuo (comprimentos de onda menores que cerca de 200 nm). A região de comprimento de onda de interesse é realmente inacessível no ar por causa da forte absorção de luz pelo oxigênio nesses comprimentos de onda. Na prática, esses espectros não são medidos no vácuo, mas em um instrumento livre de oxigênio (preenchido com gás nitrogênio puro ).

Uma vez que o oxigênio foi eliminado, talvez o segundo fator técnico mais importante para trabalhar abaixo de 200 nm seja projetar o resto do sistema óptico para ter baixas perdas nesta região. Crítico a este respeito é o uso de espelhos aluminizados cujos revestimentos foram otimizados para baixas perdas nesta região do espectro.

A fonte de luz usual nesses instrumentos é uma lâmpada de xenônio de arco curto e alta pressão . Lâmpadas de arco de xenônio comuns não são adequadas para uso em UV baixo. Em vez disso, devem ser usadas lâmpadas especialmente construídas com invólucros feitos de sílica fundida sintética de alta pureza .

A luz de fontes síncrotron tem um fluxo muito mais alto em comprimentos de onda curtos e tem sido usada para gravar CDs até 160 nm. Em 2010, o espectrofotômetro de CD na instalação de anel de armazenamento de elétrons ISA na Universidade de Aarhus, na Dinamarca, foi usado para registrar espectros de CD de estado sólido até 120 nm. No nível da mecânica quântica , a densidade de características de dicroísmo circular e rotação óptica são idênticas. A dispersão rotativa óptica e o dicroísmo circular compartilham o mesmo conteúdo de informação quântica .

Veja também

Referências

links externos