Cromatografia - Chromatography

A cromatografia em camada fina é usada para separar os componentes de um extrato vegetal, ilustrando o experimento com pigmentos vegetais que deram o nome à cromatografia

Em análise química , a cromatografia é uma técnica de laboratório para a separação de uma mistura. A mistura é dissolvida em um fluido (gás ou solvente) denominado fase móvel, que a transporta por meio de um sistema (coluna, tubo capilar, placa ou folha) no qual é fixado um material denominado fase estacionária . Os diferentes constituintes da mistura têm diferentes afinidades para a fase estacionária. As diferentes moléculas permanecem mais ou menos na fase estacionária, dependendo de suas interações com seus locais de superfície. Portanto, eles viajam em diferentes velocidades aparentes no fluido móvel, fazendo com que se separem. A separação é baseada na partição diferencial entre as fases móvel e estacionária. Diferenças sutis no coeficiente de partição de um composto resultam em retenção diferencial na fase estacionária e, portanto, afetam a separação.

A cromatografia pode ser preparativa ou analítica. O objetivo da cromatografia preparativa é separar os componentes de uma mistura para uso posterior e, portanto, é uma forma de purificação . A cromatografia analítica é feita normalmente com menores quantidades de material e serve para estabelecer a presença ou medir as proporções relativas de analitos em uma mistura. Os dois não são mutuamente exclusivos.

Etimologia e pronúncia

Cromatografia, pronunciada / ˌ k r m ə t do ɒ do ɡ r ə f i / , é derivado de grego χρῶμα croma , os quais meios de " cor ", e γράφειν graphein , que significa "escrita". A combinação desses dois termos foi herdada diretamente da invenção da técnica usada pela primeira vez para separar os pigmentos.

História

A cromatografia foi desenvolvida pela primeira vez na Rússia pelo cientista italiano Mikhail Tsvet em 1900. Ele desenvolveu a técnica, ele cunhou a cromatografia, na primeira década do século 20, principalmente para a separação de pigmentos vegetais como clorofila , carotenos e xantofilas . Como esses componentes se separam em faixas de cores diferentes (verde, laranja e amarelo, respectivamente), inspiraram diretamente o nome da técnica. Novos tipos de cromatografia desenvolvidos durante as décadas de 1930 e 1940 tornaram a técnica útil para muitos processos de separação .

A técnica de cromatografia desenvolveu-se substancialmente como resultado do trabalho de Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge durante as décadas de 1940 e 1950, pelos quais eles ganharam o Prêmio Nobel de Química em 1952 . Eles estabeleceram os princípios e as técnicas básicas da cromatografia de partição e seu trabalho incentivou o rápido desenvolvimento de vários métodos cromatográficos: cromatografia em papel , cromatografia gasosa e o que viria a ser conhecido como cromatografia líquida de alto desempenho . Desde então, a tecnologia avançou rapidamente. Os pesquisadores descobriram que os princípios básicos da cromatografia de Tsvet podem ser aplicados de muitas maneiras diferentes, resultando nas diferentes variedades de cromatografia descritas a seguir. Os avanços aprimoram continuamente o desempenho técnico da cromatografia, permitindo a separação de moléculas cada vez mais semelhantes.

Termos de cromatografia

  • Analito - a substância a ser separada durante a cromatografia. Normalmente também é o que é necessário da mistura.
  • Cromatografia analítica - o uso de cromatografia para determinar a existência e possivelmente também a concentração de analito (s) em uma amostra .
  • Fase ligada - uma fase estacionária que é ligada covalentemente às partículas de suporte ou à parede interna do tubo da coluna.
  • Cromatograma - a saída visual do cromatógrafo. No caso de uma separação ideal, diferentes picos ou padrões no cromatograma correspondem a diferentes componentes da mistura separada.
    Cromatograma com picos não resolvidos Cromatograma com dois picos resolvidos
    Traçado no eixo x está o tempo de retenção e traçado no eixo y um sinal (por exemplo, obtido por um espectrofotômetro , espectrômetro de massa ou uma variedade de outros detectores) correspondendo à resposta criada pelos analitos que saem do sistema. No caso de um sistema ideal, o sinal é proporcional à concentração do analito específico separado.
  • Cromatógrafo ou aerógrafo - um instrumento que permite uma separação sofisticada, por exemplo, cromatografia gasosa ou separação cromatográfica líquida.
  • Cromatografia - método físico de separação que distribui componentes para separar entre duas fases, uma estacionária (fase estacionária), a outra (a fase móvel) movendo-se em uma direção definida.
  • Eluente (às vezes soletrado como eluente ) - o solvente ou mistura de solventes usada na cromatografia de eluição e é sinônimo de fase móvel .
  • Eluato - a mistura de soluto (veja Eluite) e solvente (veja Eluente) saindo da coluna.
  • Efluente - o fluxo que flui de uma coluna cromatográfica. Na prática, é usado como sinônimo de eluato , mas o termo se refere mais precisamente ao fluxo independente da separação que está ocorrendo.
  • Eluite - um termo mais preciso para soluto ou analito . É um componente da amostra que sai da coluna cromatográfica.
  • Séries eluotrópicas - uma lista de solventes classificados de acordo com seu poder de eluição.
  • Fase imobilizada - fase estacionária que é imobilizada nas partículas de suporte, ou na parede interna do tubo da coluna.
  • fase móvel - a fase que se move em uma direção definida. Pode ser um líquido (LC e Eletrocromatografia Capilar (CEC)), um gás (GC) ou um fluido supercrítico (cromatografia de fluido supercrítico, SFC). A fase móvel consiste na separação / análise da amostra e no solvente que a movimenta na coluna. No caso de HPLC, a fase móvel consiste em um ou mais solventes não polares, como hexano na fase normal, ou um solvente polar, como metanol em cromatografia de fase reversa e a amostra sendo separada. A fase móvel se move através da coluna de cromatografia (a fase estacionária) onde a amostra interage com a fase estacionária e é separada.
  • Cromatografia preparativa - o uso de cromatografia para purificar quantidades suficientes de uma substância para uso posterior, em vez de análise.
  • Tempo de retenção - o tempo característico que leva para um analito específico passar pelo sistema (da entrada da coluna ao detector) sob condições definidas. Veja também: índice de retenção de Kovats
  • Amostra - matéria analisada em cromatografia. Pode consistir em um único componente ou pode ser uma mistura de componentes. Quando a amostra é tratada no decurso de uma análise, a fase ou as fases que contêm os analitos de interesse são referidas como a amostra, enquanto tudo fora de interesse separado da amostra antes ou no decurso da análise é referido como desperdício.
  • Soluto - os componentes da amostra na cromatografia de partição.
  • Solvente - qualquer substância capaz de solubilizar outra substância e, principalmente, a fase móvel líquida na cromatografia líquida.
  • Fase estacionária - a substância fixada no local para o procedimento de cromatografia. Os exemplos incluem a camada de sílica na cromatografia de camada fina
  • Detector - o instrumento usado para a detecção qualitativa e quantitativa de analitos após a separação.

A cromatografia é baseada no conceito de coeficiente de partição. Qualquer partição de soluto entre dois solventes imiscíveis. Quando tornamos um solvente imóvel (por adsorção em uma matriz de suporte sólida) e outro móvel, isso resulta nas aplicações mais comuns de cromatografia. Se o suporte da matriz, ou fase estacionária, for polar (por exemplo, papel, sílica, etc.), é cromatografia de fase direta, e se for apolar (C-18), é fase reversa.

Técnicas por forma de leito cromatográfico

Cromatografia em coluna

Column chromatography sequence.png

A cromatografia em coluna é uma técnica de separação na qual o leito estacionário fica dentro de um tubo. As partículas da fase estacionária sólida ou do suporte revestido com uma fase estacionária líquida podem preencher todo o volume interno do tubo (coluna empacotada) ou ser concentradas na ou ao longo da parede interna do tubo, deixando um caminho aberto e irrestrito para a fase móvel em a parte média do tubo (coluna tubular aberta). As diferenças nas taxas de movimento através do meio são calculadas para diferentes tempos de retenção da amostra. Em 1978, W. Clark Still introduziu uma versão modificada da cromatografia em coluna chamada cromatografia em coluna flash (flash). A técnica é muito semelhante à cromatografia em coluna tradicional, exceto que o solvente é conduzido através da coluna pela aplicação de pressão positiva. Isso permitiu que a maioria das separações fosse realizada em menos de 20 minutos, com separações melhoradas em comparação com o método antigo. Os modernos sistemas de cromatografia flash são vendidos como cartuchos de plástico pré-embalados e o solvente é bombeado através do cartucho. Os sistemas também podem ser ligados a detectores e coletores de frações, proporcionando automação. A introdução de bombas de gradiente resultou em separações mais rápidas e menos uso de solvente.

Na adsorção em leito expandido , um leito fluidizado é usado, ao invés de uma fase sólida feita por um leito empacotado. Isso permite a omissão de etapas de limpeza iniciais, como centrifugação e filtração, para caldos de cultura ou pastas de células quebradas.

A cromatografia de fosfocelulose utiliza a afinidade de ligação de muitas proteínas de ligação ao DNA para a fosfocelulose. Quanto mais forte for a interação de uma proteína com o DNA, maior será a concentração de sal necessária para eluir essa proteína.

Cromatografia plana

A cromatografia plana é uma técnica de separação em que a fase estacionária está presente como ou em um plano. O plano pode ser um papel, servindo como tal ou impregnado por uma substância como leito estacionário ( cromatografia em papel ) ou uma camada de partículas sólidas espalhada sobre um suporte como uma placa de vidro ( cromatografia em camada delgada ). Diferentes compostos na mistura da amostra percorrem distâncias diferentes de acordo com a intensidade com que interagem com a fase estacionária em comparação com a fase móvel. O fator de retenção específico (R f ) de cada produto químico pode ser usado para auxiliar na identificação de uma substância desconhecida.

Cromatografia de papel

Cromatografia de papel em andamento
Cromatografia de papel

A cromatografia em papel é uma técnica que envolve a colocação de um pequeno ponto ou linha de solução de amostra em uma tira de papel de cromatografia . O papel é colocado em um recipiente com uma camada rasa de solvente e lacrado. À medida que o solvente sobe pelo papel, ele encontra a mistura da amostra, que começa a subir no papel com o solvente. Este papel é feito de celulose , uma substância polar , e os compostos dentro da mistura viajam mais longe se forem menos polares. Substâncias mais polares se ligam ao papel de celulose mais rapidamente e, portanto, não viajam para tão longe.

Cromatografia de camada fina (TLC)

Cromatografia de camada fina

A cromatografia em camada fina (TLC) é uma técnica de laboratório amplamente utilizada para separar diferentes compostos bioquímicos com base em suas atrações relativas às fases estacionária e móvel. É semelhante à cromatografia em papel . No entanto, em vez de usar uma fase estacionária de papel, envolve uma fase estacionária de uma fina camada de adsorvente como sílica gel , alumina ou celulose em um substrato plano e inerte . TLC é muito versátil; várias amostras podem ser separadas simultaneamente na mesma camada, tornando-o muito útil para aplicações de triagem, como teste de níveis de drogas e pureza da água. A possibilidade de contaminação cruzada é baixa, pois cada separação é realizada em uma nova camada. Comparado ao papel, tem a vantagem de rodar mais rápido, melhores separações, melhor análise quantitativa e a escolha entre diferentes adsorventes. Para uma resolução ainda melhor e uma separação mais rápida que utiliza menos solvente, pode ser usado o TLC de alto desempenho . Um antigo uso popular era diferenciar cromossomos observando a distância no gel (a separação de era uma etapa separada).

Cromatografia de deslocamento

O princípio básico da cromatografia de deslocamento é: Uma molécula com alta afinidade para a matriz de cromatografia (o deslocador) compete efetivamente pelos locais de ligação e, portanto, desloca todas as moléculas com afinidades menores. Existem diferenças distintas entre cromatografia de deslocamento e eluição. No modo de eluição, as substâncias normalmente emergem de uma coluna em picos estreitos de Gauss. Uma ampla separação de picos, de preferência até a linha de base, é desejada para a purificação máxima. A velocidade na qual qualquer componente de uma mistura viaja pela coluna no modo de eluição depende de muitos fatores. Mas para que duas substâncias viajem em velocidades diferentes e, portanto, sejam resolvidas, deve haver diferenças substanciais em alguma interação entre as biomoléculas e a matriz de cromatografia. Os parâmetros operacionais são ajustados para maximizar o efeito dessa diferença. Em muitos casos, a separação da linha de base dos picos pode ser alcançada apenas com eluição de gradiente e carregamentos de coluna baixos. Assim, duas desvantagens da cromatografia de modo de eluição, especialmente na escala preparativa, são a complexidade operacional, devido ao bombeamento de solvente de gradiente, e o baixo rendimento, devido a carregamentos de coluna baixos. A cromatografia de deslocamento tem vantagens sobre a cromatografia de eluição em que os componentes são resolvidos em zonas consecutivas de substâncias puras em vez de "picos". Como o processo tira vantagem da não linearidade das isotérmicas, uma alimentação de coluna maior pode ser separada em uma determinada coluna com os componentes purificados recuperados em concentrações significativamente mais altas.

Técnicas por estado físico da fase móvel

Cromatografia em fase gasosa

A cromatografia gasosa (GC), também conhecida como cromatografia gás-líquido (GLC), é uma técnica de separação na qual a fase móvel é um gás. A separação por cromatografia gasosa é sempre realizada em coluna, normalmente "empacotada" ou "capilar". Colunas empacotadas são os cavalos de trabalho rotineiros da cromatografia gasosa, sendo mais baratas e fáceis de usar e frequentemente apresentando desempenho adequado. As colunas capilares geralmente oferecem resolução muito superior e, embora mais caras, estão se tornando amplamente utilizadas, especialmente para misturas complexas. Além disso, as colunas capilares podem ser divididas em três classes: colunas tubulares abertas de camada porosa (PLOT), tubulares abertas revestidas de parede (WCOT) e tubulares abertas revestidas de suporte (SCOT). As colunas PLOT são únicas no sentido de que a fase estacionária é adsorvida às paredes da coluna, enquanto as colunas WCOT têm uma fase estacionária que é quimicamente ligada às paredes. As colunas SCOT são de certa forma a combinação dos dois tipos mencionados de forma que possuem partículas de suporte aderidas às paredes da coluna, mas essas partículas possuem fase líquida quimicamente ligada a elas. Ambos os tipos de coluna são feitos de materiais não adsorventes e quimicamente inertes. Aço inoxidável e vidro são os materiais usuais para colunas empacotadas e quartzo ou sílica fundida para colunas capilares.

A cromatografia gasosa é baseada em um equilíbrio de partição do analito entre uma fase estacionária sólida ou líquida viscosa (geralmente um material à base de silicone líquido) e um gás móvel (na maioria das vezes hélio). A fase estacionária é aderida ao interior de um tubo de vidro ou de sílica fundida (uma coluna capilar) de pequeno diâmetro (comumente 0,53 - 0,18 mm de diâmetro interno) ou uma matriz sólida dentro de um tubo de metal maior (uma coluna compactada). É amplamente utilizado em química analítica ; embora as altas temperaturas usadas em GC o tornem impróprio para biopolímeros ou proteínas de alto peso molecular (o calor os desnatura), freqüentemente encontrados em bioquímica , ele é adequado para uso nos campos petroquímico , monitoramento e remediação ambiental e química industrial . Também é amplamente utilizado na pesquisa química.

Cromatografia liquida

Aparelho de HPLC preparativo

A cromatografia líquida (LC) é uma técnica de separação em que a fase móvel é um líquido. Pode ser realizada em coluna ou em plano. A cromatografia líquida atual, que geralmente utiliza partículas de empacotamento muito pequenas e uma pressão relativamente alta, é referida como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

Em HPLC, a amostra é forçada por um líquido em alta pressão (a fase móvel) através de uma coluna que é preenchida com uma fase estacionária composta de partículas de formato irregular ou esférico, uma camada monolítica porosa ou uma membrana porosa. HPLC é historicamente dividido em duas subclasses diferentes com base na polaridade das fases móvel e estacionária. Métodos em que a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel (por exemplo, tolueno como a fase móvel, sílica como a fase estacionária) são denominados cromatografia líquida de fase normal (NPLC) e o oposto (por exemplo, mistura de água-metanol como o móvel fase e C18 ( octadecilsilil ) como a fase estacionária) é denominado cromatografia líquida de fase reversa (RPLC).

Técnicas específicas sob este amplo título estão listadas abaixo.

Cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade é baseada na interação não covalente seletiva entre um analito e moléculas específicas. É muito específico, mas não muito robusto. É frequentemente usado em bioquímica na purificação de proteínas ligadas a tags. Estas proteínas de fusão são marcadas com compostos como His-tags , biotina ou antígenos , que se ligam especificamente à fase estacionária. Após a purificação, essas marcas são geralmente removidas e a proteína pura é obtida.

A cromatografia de afinidade frequentemente utiliza a afinidade de uma biomolécula por um metal (Zn, Cu, Fe, etc.). As colunas geralmente são preparadas manualmente. As colunas de afinidade tradicionais são usadas como uma etapa preparativa para eliminar biomoléculas indesejadas.

No entanto, existem técnicas de cromatografia líquida que utilizam propriedades de cromatografia de afinidade. A cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) é útil para separar as moléculas acima mencionadas com base na afinidade relativa para o metal. Freqüentemente, essas colunas podem ser carregadas com metais diferentes para criar uma coluna com uma afinidade direcionada.

Cromatografia de fluido supercrítico

A cromatografia de fluido supercrítico é uma técnica de separação em que a fase móvel é um fluido acima e relativamente próximo de sua temperatura e pressão críticas.

Técnicas por mecanismo de separação

Cromatografia de troca iônica

A cromatografia de troca iônica (geralmente referida como cromatografia iônica) usa um mecanismo de troca iônica para separar analitos com base em suas respectivas cargas. Geralmente é executado em colunas, mas também pode ser útil no modo planar. A cromatografia de troca iônica usa uma fase estacionária carregada para separar compostos carregados, incluindo ânions , cátions , aminoácidos , peptídeos e proteínas . Em métodos convencionais, a fase estacionária é uma resina de troca iônica que carrega grupos funcionais carregados que interagem com grupos de carga oposta do composto para reter. Existem dois tipos de cromatografia de troca iônica: troca catiônica e troca aniônica. Na cromatografia de troca catiônica a fase estacionária tem carga negativa e o íon trocável é um cátion, enquanto na cromatografia de troca aniônica a fase estacionária tem carga positiva e o íon trocável é um ânion. A cromatografia de troca iônica é comumente usada para purificar proteínas usando FPLC .

Cromatografia de exclusão de tamanho

A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) também é conhecida como cromatografia de permeação em gel (GPC) ou cromatografia de filtração em gel e separa as moléculas de acordo com seu tamanho (ou mais precisamente de acordo com seu diâmetro hidrodinâmico ou volume hidrodinâmico). Moléculas menores são capazes de entrar nos poros do meio e, portanto, as moléculas são aprisionadas e retiradas do fluxo da fase móvel. O tempo médio de residência nos poros depende do tamanho efetivo das moléculas de analito. No entanto, as moléculas que são maiores do que o tamanho médio dos poros do empacotamento são excluídas e, portanto, essencialmente não sofrem retenção; tais espécies são as primeiras a serem eluídas. Geralmente é uma técnica de cromatografia de baixa resolução e, portanto, costuma ser reservada para a etapa final de "polimento" de uma purificação. Também é útil para determinar a estrutura terciária e a estrutura quaternária de proteínas purificadas, especialmente porque pode ser realizada em condições de solução nativa.

Separação cromatográfica de adsorção em leito expandido

Uma coluna de adsorção cromatográfica de leito expandido (EBA) para um processo de separação bioquímica compreende um distribuidor de líquido de equalização de pressão tendo uma função de autolimpeza abaixo de uma placa de peneira de bloqueio porosa no fundo do leito expandido, um conjunto de bocal de parte superior tendo uma função de limpeza de retrolavagem no topo do leito expandido, uma melhor distribuição do licor de matéria-prima adicionado ao leito expandido garantindo que o fluido passou através da camada de leito expandido exibe um estado de fluxo de pistão. A camada de leito expandido exibe um estado de fluxo do pistão. A coluna de separação cromatográfica de leito expandido tem vantagens de aumentar a eficiência de separação do leito expandido.

A cromatografia de adsorção em leito expandido (EBA) é uma técnica conveniente e eficaz para a captura de proteínas diretamente de uma amostra bruta não esclarecida. Na cromatografia EBA, o leito estabelecido é primeiro expandido pelo fluxo ascendente do tampão de equilíbrio. A alimentação bruta, uma mistura de proteínas solúveis, contaminantes, células e resíduos celulares, é então passada para cima através do leito expandido. As proteínas alvo são capturadas no adsorvente, enquanto particulados e contaminantes passam. Uma mudança no tampão de eluição, mantendo o fluxo ascendente, resulta na dessorção da proteína alvo no modo de leito expandido. Alternativamente, se o fluxo for invertido, as partículas adsorvidas irão se depositar rapidamente e as proteínas podem ser dessorvidas por um tampão de eluição. O modo usado para a eluição (leito expandido versus leito assentado) depende das características da alimentação. Após a eluição, o adsorvente é limpo com uma solução pré-definida de limpeza no local (CIP), com limpeza seguida por regeneração da coluna (para uso posterior) ou armazenamento.

Técnicas especiais

Cromatografia de fase reversa

A cromatografia de fase reversa (RPC) é qualquer procedimento de cromatografia líquida em que a fase móvel é significativamente mais polar do que a fase estacionária. É assim chamada porque na cromatografia líquida de fase normal, a fase móvel é significativamente menos polar do que a fase estacionária. As moléculas hidrofóbicas na fase móvel tendem a se adsorver à fase estacionária relativamente hidrofóbica. As moléculas hidrofílicas na fase móvel tendem a eluir primeiro. As colunas de separação tipicamente compreendem uma cadeia de carbono C8 ou C18 ligada a um substrato de partícula de sílica.

Cromatografia de interação hidrofóbica

A Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) é uma técnica de purificação e analítica que separa analitos, como proteínas, com base nas interações hidrofóbicas entre esse analito e a matriz cromatográfica. Pode fornecer uma abordagem ortogonal não desnaturante para a separação de fase reversa, preservando as estruturas nativas e potencialmente a atividade da proteína. Na cromatografia de interação hidrofóbica, o material da matriz é ligeiramente substituído por grupos hidrofóbicos. Esses grupos podem variar de grupos metil, etil, propil, butil, octilo ou fenil. Em altas concentrações de sal, cadeias laterais não polares na superfície das proteínas "interagem" com os grupos hidrofóbicos; isto é, ambos os tipos de grupos são excluídos pelo solvente polar (os efeitos hidrofóbicos são aumentados pelo aumento da força iônica). Assim, a amostra é aplicada à coluna em um tampão que é altamente polar, que conduz uma associação de manchas hidrofóbicas no analito com a fase estacionária. O eluente é tipicamente um tampão aquoso com concentrações decrescentes de sal, concentrações crescentes de detergente (que interrompe as interações hidrofóbicas) ou mudanças no pH. De importância crítica é o tipo de sal usado, com mais sais kosmotrópicos , conforme definido pela série Hofmeister, fornecendo a maior estruturação de água em torno da molécula e a pressão hidrofóbica resultante. O sulfato de amônio é freqüentemente usado para essa finalidade. A adição de solventes orgânicos ou outros constituintes menos polares pode ajudar a melhorar a resolução.

Em geral, a Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) é vantajosa se a amostra for sensível à mudança de pH ou a solventes agressivos normalmente usados ​​em outros tipos de cromatografia, mas não a altas concentrações de sal. Normalmente, é a quantidade de sal no tampão que varia. Em 2012, Müller e Franzreb descreveram os efeitos da temperatura no HIC usando albumina de soro bovino (BSA) com quatro tipos diferentes de resina hidrofóbica. O estudo alterou a temperatura para efetuar a afinidade de ligação do BSA à matriz. Concluiu-se que a temperatura de ciclo de 50 a 10 graus não seria adequada para lavar eficazmente todo o BSA da matriz, mas poderia ser muito eficaz se a coluna fosse usada apenas algumas vezes. Usar a temperatura para efetuar mudanças permite que os laboratórios cortem custos na compra de sal e economizem dinheiro.

Se as altas concentrações de sal junto com as flutuações de temperatura quiserem ser evitadas, você pode usar um método mais hidrofóbico para competir com sua amostra para eluí-lo. [fonte] Este método denominado HIC independente de sal mostrou um isolamento direto de Imunoglobulina G humana (IgG) do soro com rendimento satisfatório e usou Beta-ciclodextrina como competidor para deslocar IgG da matriz. Isso abre amplamente a possibilidade de usar HIC com amostras que são sensíveis ao sal, pois sabemos que altas concentrações de sal precipitam proteínas.

Cromatografia hidrodinâmica

A cromatografia hidrodinâmica (HDC) é derivada do fenômeno observado de que as gotas grandes se movem mais rápido do que as pequenas. Em uma coluna, isso acontece porque o centro de massa de gotas maiores é impedido de ficar tão próximo dos lados da coluna quanto as gotas menores devido ao seu tamanho geral maior. Gotas maiores irão eluir primeiro do meio da coluna, enquanto as gotas menores grudam nas laterais da coluna e eluem por último. Esta forma de cromatografia é útil para separar analitos por massa molar , tamanho, forma e estrutura quando usada em conjunto com detectores de dispersão de luz , viscosímetros e refratômetros . Os dois tipos principais de HDC são tubo aberto e coluna empacotada . O tubo aberto oferece tempos de separação rápidos para partículas pequenas, enquanto a coluna empacotada HDC pode aumentar a resolução e é mais adequada para partículas com massa molecular média maior do que daltons . HDC difere de outros tipos de cromatografia porque a separação ocorre apenas no volume intersticial, que é o volume ao redor e entre as partículas em uma coluna empacotada.

HDC compartilha a mesma ordem de eluição que a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), mas os dois processos ainda variam de várias maneiras. Em um estudo comparando os dois tipos de separação, Isenberg, Brewer, Côté e Striegel usam ambos os métodos para caracterização de polissacarídeos e concluem que HDC acoplado com espalhamento de luz multiangular (MALS) atinge distribuição de massa molar mais precisa quando comparado com MALS off-line do que SEC em muito menos tempo. Isso se deve em grande parte ao SEC ser uma técnica mais destrutiva por causa dos poros na coluna que degradam o analito durante a separação, o que tende a impactar a distribuição de massa. No entanto, a principal desvantagem do HDC é a baixa resolução dos picos do analito, o que torna o SEC uma opção mais viável quando usado com produtos químicos que não são facilmente degradáveis ​​e onde a eluição rápida não é importante.

HDC desempenha um papel especialmente importante no campo da microfluídica . O primeiro aparelho de sucesso para o sistema HDC-on-a-chip foi proposto por Chmela, et al. em 2002. Seu projeto foi capaz de realizar separações usando um canal de 80 mm de comprimento na escala de tempo de 3 minutos para partículas com diâmetros variando de 26 a 110 nm, mas os autores expressaram a necessidade de melhorar os parâmetros de retenção e dispersão . Em uma publicação de 2010 por Jellema, Markesteijn, Westerweel e Verpoorte, a implementação de HDC com fluxo bidirecional recirculante resultou em alta resolução, separação baseada em tamanho com apenas um canal de 3 mm de comprimento. Ter um canal tão curto e alta resolução foi visto como especialmente impressionante, considerando que estudos anteriores usaram canais com 80 mm de comprimento. Para uma aplicação biológica, em 2007, Huh, et al. propôs um dispositivo de classificação microfluídica baseado em HDC e gravidade, que foi útil para evitar que partículas potencialmente perigosas com diâmetro maior que 6 mícrons entrassem na corrente sanguínea ao injetar agentes de contraste em ultrassons . Este estudo também fez avanços para a sustentabilidade ambiental em microfluídica devido à falta de eletrônicos externos direcionando o fluxo, o que veio como uma vantagem de usar um dispositivo baseado na gravidade.

Cromatógrafo bidimensional GCxGC-TOFMS na Faculdade de Química de GUT Gdańsk , Polônia , 2016

Cromatografia bidimensional

Em alguns casos, a seletividade fornecida pelo uso de uma coluna pode ser insuficiente para fornecer resolução de analitos em amostras complexas. A cromatografia bidimensional visa aumentar a resolução desses picos usando uma segunda coluna com diferentes propriedades físico-químicas ( classificação química ). Como o mecanismo de retenção neste novo suporte sólido é diferente da separação da primeira dimensão, pode ser possível separar compostos por cromatografia bidimensional que são indistinguíveis por cromatografia unidimensional. Além disso, a separação na segunda dimensão ocorre mais rápido do que na primeira dimensão. Um exemplo de uma separação TLC bidimensional é quando a amostra é colocada em um canto de uma placa quadrada, revelada, seca ao ar, girada 90 ° e geralmente desenvolvida novamente em um segundo sistema de solvente. A cromatografia bidimensional pode ser aplicada a separações GC ou LC. Este método de separação também pode ser usado em uma abordagem cortante, onde regiões específicas de interesse na primeira dimensão são selecionadas para separação pela segunda dimensão, ou em uma abordagem abrangente, onde todos os analitos da primeira dimensão passam pela segunda dimensão separação.

Cromatografia de leito móvel simulado

A técnica de leito móvel simulado (SMB) é uma variante da cromatografia líquida de alto desempenho; é usado para separar partículas e / ou compostos químicos que seriam difíceis ou impossíveis de resolver de outra forma. Esta separação aumentada é provocada por um arranjo de válvula e coluna que é usado para alongar a fase estacionária indefinidamente. Na técnica de leito móvel de cromatografia preparativa, a entrada da alimentação e a recuperação do analito são simultâneas e contínuas, mas devido às dificuldades práticas com um leito em movimento contínuo, foi proposta a técnica de leito móvel simulado. Na técnica de leito móvel simulado, em vez de mover o leito, a entrada da amostra e as posições de saída do analito são movidas continuamente, dando a impressão de um leito em movimento. A verdadeira cromatografia em leito móvel (TMBC) é apenas um conceito teórico. Sua simulação, SMBC, é obtida pelo uso de uma multiplicidade de colunas em série e um complexo arranjo de válvula, que fornece amostra e alimentação de solvente, e também analito e retirada de resíduos em locais apropriados de qualquer coluna, permitindo a troca em intervalos regulares a entrada da amostra em uma direção, a entrada do solvente na direção oposta, ao mesmo tempo em que altera as posições de decolagem do analito e do resíduo apropriadamente.

Cromatografia gasosa de pirólise

Pirólise - cromatografia gasosa - espectrometria de massa é um método de análise química em que a amostra é aquecida até a decomposição para produzir moléculas menores que são separadas por cromatografia gasosa e detectadas por espectrometria de massa.

A pirólise é a decomposição térmica de materiais em uma atmosfera inerte ou no vácuo. A amostra é colocada em contato direto com um fio de platina ou colocada em um tubo de amostra de quartzo e rapidamente aquecida a 600–1000 ° C. Dependendo da aplicação, temperaturas ainda mais altas são utilizadas. Três técnicas diferentes de aquecimento são usadas em pirolisadores reais: forno isotérmico, aquecimento indutivo (filamento de Curie Point) e aquecimento resistivo usando filamentos de platina. Moléculas grandes se clivam em seus pontos mais fracos e produzem fragmentos menores e mais voláteis. Esses fragmentos podem ser separados por cromatografia gasosa. Cromatogramas de pirólise GC são tipicamente complexos porque uma ampla gama de diferentes produtos de decomposição é formada. Os dados podem ser usados ​​como impressão digital para provar a identidade do material ou os dados GC / MS são usados ​​para identificar fragmentos individuais para obter informações estruturais. Para aumentar a volatilidade dos fragmentos polares, vários reagentes de metilação podem ser adicionados a uma amostra antes da pirólise.

Além do uso de pirolisadores dedicados, a pirólise GC de amostras sólidas e líquidas pode ser realizada diretamente dentro de injetores de Vaporizador de Temperatura Programável (PTV) que fornecem aquecimento rápido (até 30 ° C / s) e altas temperaturas máximas de 600–650 ° C. Isso é suficiente para algumas aplicações de pirólise. A principal vantagem é que nenhum instrumento dedicado precisa ser comprado e a pirólise pode ser realizada como parte da análise de GC de rotina. Neste caso, devem ser usados ​​liners de entrada GC de quartzo. Dados quantitativos podem ser adquiridos, e bons resultados de derivatização dentro do injetor PTV também são publicados.

Cromatografia rápida de proteína líquida

A cromatografia líquida rápida de proteínas (FPLC) é uma forma de cromatografia líquida frequentemente usada para analisar ou purificar misturas de proteínas. Como em outras formas de cromatografia, a separação é possível porque os diferentes componentes de uma mistura têm afinidades diferentes para dois materiais, um fluido em movimento (a "fase móvel") e um sólido poroso (a fase estacionária). Em FPLC, a fase móvel é uma solução aquosa, ou "tampão". A taxa de fluxo do buffer é controlada por uma bomba de deslocamento positivo e normalmente é mantida constante, enquanto a composição do buffer pode ser variada extraindo fluidos em diferentes proporções de dois ou mais reservatórios externos. A fase estacionária é uma resina composta por grânulos, geralmente de agarose reticulada, acondicionados em uma coluna cilíndrica de vidro ou plástico. As resinas FPLC estão disponíveis em uma ampla gama de tamanhos de grânulos e ligantes de superfície, dependendo da aplicação.

Cromatografia contracorrente

A cromatografia em contracorrente (CCC) é um tipo de cromatografia líquido-líquido, em que as fases estacionária e móvel são líquidas e a fase estacionária líquida é mantida estagnada por uma forte força centrífuga.

Cromatografia hidrodinâmica contracorrente (CCC)

O princípio de operação do instrumento CCC requer uma coluna que consiste em um tubo aberto enrolado em torno de uma bobina. A bobina é girada em um movimento giratório de eixo duplo (um cardióide), o que faz com que um campo de gravidade variável (G) atue na coluna durante cada rotação. Este movimento faz com que a coluna veja uma etapa de partição por revolução e os componentes da amostra se separem na coluna devido ao seu coeficiente de partição entre as duas fases líquidas imiscíveis usadas. Existem muitos tipos de CCC disponíveis hoje. Isso inclui HSCCC (High Speed ​​CCC) e HPCCC (High Performance CCC). HPCCC é a versão mais recente e de melhor desempenho da instrumentação disponível atualmente.

Cromatografia de contracorrente hidrostática ou cromatografia de partição centrífuga (CPC)

No instrumento CPC, a coluna consiste em uma série de células interconectadas por dutos acoplados a um rotor. Este rotor gira em seu eixo central, criando o campo centrífugo necessário para manter a fase estacionária no lugar. O processo de separação no CPC é governado exclusivamente pela partição de solutos entre as fases estacionária e móvel, mecanismo esse que pode ser facilmente descrito usando os coeficientes de partição ( K D ) dos solutos. Os instrumentos CPC estão disponíveis comercialmente para separações em escala laboratorial, piloto e industrial com diferentes tamanhos de colunas que variam de cerca de 10 mililitros a 10 litros de volume.

Cromatografia contra-corrente periódica

Em contraste com a cromatografia contra-corrente (veja acima), a cromatografia contra-corrente periódica (PCC) usa uma fase estacionária sólida e apenas uma fase móvel líquida. Portanto, é muito mais semelhante à cromatografia de afinidade convencional do que à cromatografia de contracorrente. O PCC usa várias colunas, que durante a fase de carregamento são conectadas em linha. Este modo permite sobrecarregar a primeira coluna desta série sem perder o produto, que já rompe a coluna antes que a resina esteja totalmente saturada. O produto inovador é capturado na (s) coluna (s) subsequente (s). Em uma próxima etapa, as colunas são desconectadas umas das outras. A primeira coluna é lavada e eluída, enquanto a (s) outra (s) coluna (s) ainda estão sendo carregadas. Uma vez que a (inicialmente) primeira coluna é reequilibrada, ela é reintroduzida no fluxo de carregamento, mas como última coluna. O processo então continua de forma cíclica.

Cromatografia quiral

A cromatografia quiral envolve a separação de estereoisômeros. No caso dos enantiômeros, eles não têm diferenças químicas ou físicas além de serem imagens espelhadas tridimensionais. A cromatografia convencional ou outros processos de separação são incapazes de separá-los. Para permitir que as separações quirais ocorram, a fase móvel ou a fase estacionária devem ser tornadas quirais, dando diferentes afinidades entre os analitos. Colunas de HPLC de cromatografia quiral (com uma fase estacionária quiral) em ambas as fases normal e reversa estão disponíveis comercialmente.

Cromatografia aquosa de fase normal

A cromatografia de fase normal aquosa (ANP) é caracterizada pelo comportamento de eluição do modo de fase normal clássico (isto é, onde a fase móvel é significativamente menos polar do que a fase estacionária) em que a água é um dos componentes do sistema solvente da fase móvel. É distinto da cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) em que o mecanismo de retenção é devido à adsorção em vez de partição.

Formulários

A cromatografia é usada em muitos campos, incluindo a indústria farmacêutica , a indústria de alimentos e bebidas , a indústria química , ciência forense , análise ambiental e hospitais .

Veja também

Referências

links externos